时间：2023-03-02 14:57:32
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关键词：血液集中化检测；标本；质量；无偿献血；分析
选择低危的无偿献血是安全血液的关键环节，而然，血液检测仍然是血液安全保障的重要环节之一，血液检测的质量是否得到保证，标本质量是关键，标本留样差错、标本不足量、标本抗凝不好、标本溶血等现象均可以直接影响血液检测的质量，采供血机构实行血液集中化检测， 是优化血站资源配置、保证输血安全的必然措施， 也是血站发展的必然趋势。集中检测质量更是影响到多个地区血液安全，评估血样质量是血液检测的首要任务之一，我们通过对不同情况下评估影响血液样本质量的因素，现报道如下：
1材料与方法
1.1对抗凝血样与非抗凝血样在试验过程中加样等环节对试验的影响情况进行评估。
1.2使用不同材料的试管采集血液样本，观察血液样本的溶血情况。
1.3统计一段时间血样采集情况，发现有多个组次存在血样不足量的现象，通过干预交流，连续追踪一段时间观察留样效果。
1.4使用相同材料的试管采集血样，考察不同距离运输过程对血液样本溶血情况的评估。
2结果
2.1对抗凝血样在试验加样过程纤维蛋白堵针情况与非抗凝血样在试，见表1。
2.2分别采用塑料材料的试管和玻璃材料的试管采集血样，观察其溶血情况，并进行统计分析，发现两者差异有统计学意义，见表2。
2.3血样接收过程发现存在不足量现象，回顾统计210个组次，发现6个组次存在留样不足情况 ；对存在问题与相关部门协商并进行干预后，追踪统计550组次，仅发生1个组次留样不足情况，两者比较差异有统计学意义。见表3。
2.4使用相同塑料材料采集血样，1h内运输并当天及时离心，与2h以上运输并隔夜离心，观察血液溶血情况，两者差异有统计学意义。见表4。
3讨论
血液样本留样是血液试验室检测工作的第一步，标本的采集与留样环节是整个血液检测工作的关键点，血液样本的质量对检验的最终结果有着至关重要的影响。血液标本留样目前使用标准化的真空采样管，容器加塞全密闭，减少工作人员的职业暴露，提供生物安全性 ；真空管严密性＼洁净度高，避免血样污染情况发生，高速离心过程避免气溶胶对试验室的污染，也更方便远距离血样运输。标准采样管由厂家批量生产，抗凝剂质量得到保证。血标本的采集和前处理直接影响检验数据的准确性和可靠性[1]。表1显示，非抗凝血样离心后，有时纤维蛋白析出容易在检测加样过程发生堵针现象，对非抗凝血样堵针现象进行统计分析，与同期使用抗凝血样进行比较，堵针率差异有统计学意义。溶血的标本，红细胞的破坏引起红细胞内酶类物质非特异性反应，造成假阳性结果[1]。采用不同材料的抗凝真空管，内容物一致的情况下，玻璃材料的留样真空管基本少见溶血现象，而塑料材料留样真空管发生溶血概率较大，统计不同材料采样真空管留样情况，玻璃试管352管发生溶血现象2管。塑料试管526管发生溶血现象26管，两者比较差异有统计学意义。采用相同的塑料真空管，采集血样后1h内运输当天离心发生溶血率基本在5%以内，而运输距离超过2h以上且第2d离心，发生溶血率高达20%以上，两者差异有统计学意义。
建议：最好使用玻璃资料的真空留样管采集血液样本，可以有效地避免溶血现象的发生，如果使用塑料真空留样管，最好段距离采集血液后及时运输并当天及时离心可以避免更多的溶血现象发生从而保证血液检测的质量。微板速率法检测ALT对乳糜、溶血等标本检测存在一些困难[2]。有报道[3，4]：全自动生化分析仪可以通过设置自动稀释或者浓缩程序进行标本的重新检测，检测结果可以自动覆盖初次检测结果，极大的提高了检测速率和准确率。同血样样本除了溶血、纤维蛋白、凝块析出等影响检测效果的因素外，还有留样不足现象也是直接影响集中化检测报告发放的及时性，对采集护士进行相关采集知识的培训干预及相关部门加强巡查管理工作前后，发生留样不足量现象有明显改变，干预前统计216组次发现6组次存在留样不足，干预后连续追踪550组次才发现1组次留洋不足情况，两者比较差异有统计学意义，说明血样采集与保留，除了材料因素、运输过程以及操作技术等因素影响，操作者责任性、操作核对等过程也是影响血样采集质量的重要因素。集中检测各过程加强管理是保证血液质量的关键，尤其是血液标本的管理，血液标本从采集到实验室检测，运输过程是一个保持"冷链"的过程。参与集中检测单位间应该制定统一的标本采集和运送程序，从而保证标本采集、运输的及时性和规范性。按相关规定进行安全、正确的包装[5]，避免标本运输过程激烈震动，防止溶血和外溅，确保标本质量。
参考文献：
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【摘要】 目的对亚洲带绦虫膜联蛋白B2(Annexins B2)进行克隆表达及免疫学初步研究。方法利用在线生物信息学工具从亚洲带绦虫成虫cDNA文库中筛选出Annexins B2基因，并将该基因克隆到原核表达质粒pET-28a(+)中，在大肠埃希菌BL21/DE3中诱导表达，表达产物通过十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)鉴定，重组后的蛋白用His-镍蛋白纯化柱纯化，纯化的重组蛋白用Western blotting进行免疫学分析。结果PCR、双酶切及重组质粒DNA测序均显示重组体构建成功，并得到高纯度的蛋白，且该重组蛋白可被亚洲带绦虫、猪带绦虫及牛带绦虫患者的血清识别。结论亚洲带绦虫成虫Annexins B2基因可在原核表达系统中获得具有免疫活性的高效表达。
【关键词】 亚洲带绦虫;膜联蛋白B2;基因克隆;免疫反应性
ABSTRACT: ObjectiveTo clone and express the gene named as Annexins B2 of Taenia saginata asitica so as to analyze the immunogenicity of its recombinant protein.MethodsBy online analysis of the gene at bioinfomatics websites to identify the gene from the Taenia saginata asiatica full-length cDNA plasmid library， the gene was cloned into prokaryotic expression vector pET-28a(+) and then transformed to E.coli BL21 with IPTG induction. Thereafter， the gene product was analyzed by SDS-PAGE and purified by Ni-NTA affinity chromatography. In addition， the immunoreactivity of the purified recombinant proteins was analyzed by Western blotting.ResultsAs demonstrated by PCR， double enzyme digestion and DNA sequencing indicated that the recombinant plasmid was successfully constructed and highly expressed. The recombinant protein tested with Western blotting analysis could react with Taenia asiatica and Taeniarhynchus saginatus infected patient serum.ConclusionThe Annexins B2 of Taenia saginata asitica has been cloned and expressed in the prokaryotic expression system and the purified protein has been confirmed with immunogenicity.
KEY WORDS: Taenia saginata asiatica; Annexins B2; gene cloning; immunoreactivity
鉴于亚洲带绦虫与猪带绦虫及牛带绦虫在起源、分类学地位存在的差异[1-2]，本课题组率先构建亚洲带绦虫成虫全长cDNA质粒文库，并对该虫进行功能基因组的研究工作[3]。本文利用生物信息学工具从文库中筛选到了一个膜联蛋白B2(Annexins B2)的同源基因，构建了原核表达载体，并对其原核表达产物进行免疫学方面的初步研究。
1材料与方法
1.1材料
1.1.1血清、载体与菌株3种人体带绦虫患者血清取自粪检阳性的带绦虫患者。原核表达质粒pET-28a(+)及大肠埃希菌BL-21/DE3由中山大学热带病防治教育部重点实验室惠赠。
1.1.2主要试剂和工具酶Ex Taq酶(含dNTP)，BamHⅠ，XhoⅠ，T4 DNA连接酶 (大连宝生物工程公司);异丙硫代-β-D半乳糖苷(IPTG)(美国Promega公司);质粒纯化试剂盒(广州东盛科技公司);辣根过氧化物酶标记的山羊抗猪IgG二抗、兔抗人二抗、3，3二氨基联苯胺(DAB)显色试剂盒(武汉博士德生物工程有限公司);氯化钙、氯化钠等为国产分析纯试剂。
1.2方法
1.2.1Annexins B2基因的识别及扩增将获得的亚洲带绦虫Annexins B2基因进行BLASTX分析。并根据已获得的该基因全长编码序列的开放阅读框，利用软件设计引物(引物由上海联合基因公司合成)，分别带上BamHⅠ和XhoⅠ的酶切位点进行PCR反应。
1.2.2重组原核表达质粒的构建及鉴定PCR产物和pET-28a(+)载体分别用BamHⅠ和XhoⅠ双酶切，回收、连接后转入大肠埃希菌BL-21/DE3感受态细胞，对阳性克隆依次进行质粒的提取、双酶切和PCR鉴定，并进行重组质粒DNA测序鉴定(测序由英俊科技股份有限公司完成)。
1.2.3重组蛋白的表达及纯化按照常规方法进行蛋白诱导表达，考马斯亮兰蛋白染色液染色观察蛋白表达情况。确定蛋白表达后，进行大量的诱导表达，并判断重组蛋白的可溶性，再将样品加入预先处理好的Ni-IDA His.Bind树脂亲和层析纯化柱中，最后再用PBS 24h透析以去掉过柱时留下的咪唑。
1.2.4Western blotting分析重组蛋白的免疫反应性用3种人体带绦虫患者及正常人血清与辣根过氧化物酶(HRP)标记的兔抗人IgG进行Western blotting鉴定。
2结果
2.1Annexins B2基因的识别和序列分析该基因全长922bp，编码区为224～686bp。其最大ORF为其完整编码区。
2.2原核重组质粒的鉴定将重组质粒进行PCR和双酶切鉴定，产物行0.8g/L琼脂糖凝胶电泳。结果显示在500bp左右有一清晰条带，与目的基因大小基本相符。此外，重组质粒的测序报告表明插入序列与理论序列一致，证明重组质粒构建成功(图1)。
2.2蛋白表达及纯化结果将构建好的重组质粒转化到E.coli BL/DE3中，超声裂解后SDS-PAGE电泳分析结果显示在大约25ku处出现高效表达条带(图2)，与目的蛋白基本相符。测得纯化产物的蛋白浓度为0.526g/L。
2.3Western blotting鉴定纯化蛋白的免疫反应性
用感染亚洲带绦虫、猪带绦虫、感染牛带绦虫的患者血清以及亚洲带绦虫感染猪的血清与纯化蛋白反应的结果均显示出较清晰的条带，而阴性对照血清在相应位置未识别出该蛋白条带(图3)，表明该表达产物具有良好的免疫反应性。图1重组质粒的PCR和双酶切鉴定
Fig.1 The identification of the pET-28a(+)-Ta Annexins B2 by PCR amplification and digestion with restriction enzymesM1：DNA标准(DL2000);1：PCR产物;2：pET-28a(+)质粒双酶切;3：pET-28a(+)-Annexins B2重组质粒双酶切;M2：DNA标准(DL 15000)。图2100g/L SDS-PAGE分析pET-28a(+)-Ta Annexins B2在大肠埃希菌中的表达产物及其纯化产物Fig.2 100g/L SDS-PAGE analysis of the prokaryotic expression product and purified product
M：蛋白Marker;1：pET-28a(+)IPTG未诱导;2：pET-28a(+)IPTG诱导;3：pET-28a(+)-Annexins B2 IPTG未诱导;4：pET-28a(+)-Annexins B2 IPTG诱导;5：pET-28a(+)-Annexins B2上清;6：pET-28a(+)-Annexins B2沉淀;7：pET-28a(+)-Annexins B2纯化蛋白。
3讨论
带绦虫病的流行在我国西部一直是一个严重的公共卫生问题。每年由带绦虫病造成的健康和畜牧业经济损失上百亿，严重影响西部欠发达地区的社会发展。目前，亚洲带绦虫病的防治研究的重点集中在诊断和疫苗候选抗原、药物靶标、致病的分子机制研究。图3重组蛋白的Western blotting 鉴定Fig.3 Western blotting analysis of the recombinantsM：蛋白Marker;1：纯化蛋白与亚洲带绦虫患者血清的反应结果;2：纯化蛋白与牛带绦虫患者血清的反应结果;3：纯化蛋白与猪带患者血清的反应结果;4：纯化蛋白与亚洲带绦虫感染猪血清的反应结果;5：纯化蛋白与正常人血清的反应结果。
本实验通过生物信息学方法从已经构建好的亚洲带绦虫成虫cDNA质粒文库中筛选出了一个膜联蛋白(Annexins B2)的同源基因，并且预测出该基因位于胞浆，无跨膜区，二级结构基本上是以α螺旋为主。这些都符合膜联蛋白家族的共同特征[4]。根据膜联蛋白家族分布广泛，表达丰富且稳定的特性，可以推测其在绦虫的生理活动中可能起着重要的作用。
膜联蛋白是一个广泛存在的蛋白家族，在所有真核基因组中广泛表达。具有内部重复单位和“G-X-G-T-(38residues)-D/E”基序[5]，即Ca2+结合区域的特征，用以结合带有负电的脂质。虽然它为钙结合蛋白，但是在结构上却没有EF手，而且在和Ca2+结合后，还可以与磷脂再次结合而发挥生物学效应。例如，细胞的胞吞胞吐，离子通道的形成，调节磷脂酶A2的活性及细胞内外Ca2+浓度、抗炎症反应等。在长期的生物进化过程中，膜联蛋白家族各成员在生物学特性和生理功能方面表现出非常复杂的关系，且在研究过程中发现，annexins没有信号肽，没有跨膜结构，是一个典型的细胞内蛋白。但是，却有学者发现它可以与细胞外基质发生作用。例如，抗炎[6]、抗凝[7]、抑制肿瘤[8]等。最新的研究报道，当将其作为疫苗的候选因子时，可以消除一些寄生于哺乳动物体内的寄生虫。此外，学者们认为膜联蛋白是维持细胞膜表面结构和信号转导功能的重要蛋白。并可能具有激活纤维蛋白酶原的功能，有助于破坏宿主的结缔组织，使虫体抗原更加容易进入宿主机体，诱发免疫应答。因此，对该基因的研究有助于进一步了解它的生物学功能及开辟预防治疗寄生虫病的新途径[9-10]。
目前，Annexins B2已经在猪囊尾蚴的研究被发现并命名，但是具体的生理功能还不清楚，且在亚洲带绦虫研究领域还是空白。因此，本研究将亚洲带绦虫成虫annexins克隆到原核表达质粒pET-28a(+)中，构建重组质粒，在大肠埃希菌BL-21/DE3中用IPTG诱导表达，表达产物通过SDS-PAGE电泳进行鉴定。SDS-PAGE结果表明，该蛋白在全菌和沉淀中都有表达，上清中有微量的表达，说明annexins主要表达在包涵体中。因此，进一步溶解包涵体[11]，经变性处理并亲和层析纯化后，得到了大量较纯的重组蛋白。此外，还尝试性的用上清过柱纯化并用蔗糖进行蛋白浓缩，也得到部分有活性的蛋白。Western blotting就是以抗体-抗原沉淀反应为基础的，可用于不同抗原的比较和定量。其检测结果表明所获得的重组蛋白与猪带绦虫、牛带绦虫及亚洲带绦虫有较强的交叉反应且在绦虫中的诊断特异性不高，推测其不能作为免疫诊断抗原的合适候选分子。但是，其具有免疫活性的高效表达。由此可推测它是一个具有开发潜力的基因。总之，本项研究填补了该蛋白在亚洲带绦虫研究领域的空白，也为进一步研究该基因的生物学功能及在诊断尤其是疫苗研究方面奠定了基础。
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[关键词] 国际标准化比值；口服抗凝药；华法林；准确性
[中图分类号] R446.1 [文献标识码] A [文章编号] 1674-4721（2013）05（b）-0114-03
实验室的全面质量控制（total quality control）指的是医学临床试验的过程中影响试验准确性的因素，包括试验前质量控制、试验中质量控制、试验后质量控制[1-2]。本文主要探讨口服抗凝剂（oral anticoagulants）华法林（warfarin）监测试验—凝血酶原时间（prothrombin time，PT）的国际标准化比值（international normalized ratio，INR）试验前及试验中质量控制，以了解影响国际标准化比值准确性的因素。
随着人们生活水平和医疗水平的提高，东北地区心脑血管病患者呈逐年增加的趋势，为了防止缺血性脑梗死和心脏瓣膜置换术以及冠心病合并房颤等患者出院后血栓的形成，患者均需口服华法林抗凝治疗[3]。由于华法林治疗剂量与中毒剂量十分接近，会出现出血的并发症，所以这样的患者要监测凝血酶原时间的国际标准化比值（INR）。INR=（患者PT值/正常人平均PT值）ISI。ISI指国际敏感指数（international sensitivity index，ISI），ISI值越接近1，试剂对有关凝血因子降低的敏感度越高。由于患者不同生理状态、饮食、服用药物、合并疾病对口服华法林的影响[4]以及就诊医院所使用的仪器、试剂、操作方法的不同，同一患者不同时间或不同地点所测得的凝血酶原时间的国际标准化比值（INR）有所差异。因此，探讨影响凝血酶原时间的国际标准化比值准确性的因素十分必要。
本文主要从患者饮酒、合并疾病及合并使用药物及不合格标本的使用等方面对试验前和试验中的影响因素作一些探讨，用以提高检验工作的质量。
1 资料与方法
1.1 一般资料
从2011年10月～2012年12月在本院住院或门诊就诊的62例患者，其中，心肌梗死患者预防血栓者16例，心脏瓣膜置换术后预防血栓者8例，冠心病合并房颤者9例，脑梗死预防血栓者15例，肺栓塞6例，静脉血栓患者8例。年龄45～65岁，平均年龄56岁。其中，男性37例，女性25例。平均每个患者不同时间检测7～9次PT和INR。其中27例口服华法林同时服用头孢类抗生素，6例患者患有长期腹泻，8例患者长期饮酒。
1.2 标本采集
清晨空腹采取静脉血，放于109 mmol/L枸橼酸钠抗凝管中，试剂与血液比例为1∶9，颠倒混匀4次。3000 r/s离心15 min，30 min内分离，2 h内完成对INR的测定。
1.3 仪器与试剂
仪器为Sysmex CA1500全自动血凝仪，试剂由SIEMENS公司提供，凝血酶原时间试剂，批号是：LOT545369，ISI值为1.0。
1.4 比对实验
上述27例上感患者停用头孢类类抗生素后重测，6例腹泻治疗后重测，8例饮酒者戒酒后重测，合计82例；标本量不准（过少）、溶血标本、脂血标本、标本放置时间过久者重新采集符合要求的标本重测合计92例。
1.5统计学分析
采用SPSS 13.0统计软件包进行统计学分析，计量数据以均值±标准差（x±s）表示，不合格标本与重测标本之间均数比较用独立样本t检验分析，以P < 0.05为差异有统计学意义，P < 0.01为差异有高度统计学意义。
2 结果
2.1 采血前患者状态对INR的影响
选取停用头孢类抗生素前后、腹泻治疗前后、戒酒前后INR值对比，见表1。1、2组INR对比，P值均为0.000，两组结果差异有高度统计学意义（P < 0.01）；3、4组INR对比，P < 0.05，两组差异有统计学意义；5、6组INR对比，P < 0.01，两组差异有高度统计学意义。可见口服头孢类抗生素，腹泻及饮酒对INR值有影响。
2.2 采血后不合格标本及测定时间对INR的影响
标本溶血、标本量不足、未及时测定及这类标本重采后重测结果对比，见表2。1、2组INR对比P < 0.05，两组差异有统计学意义；3、4组INR对比，P < 0.05，两组差异有统计学意义；5、6组INR对比，P < 0.01，差异有高度统计学意义。可见标本溶血，采集的标本量不足及标本放置过久未及时测定对INR值有影响。
3 讨论
3.1 采血前的因素对的凝血酶原时间的国际标准化比值的影响机制
采血前的因素对的凝血酶原时间的国际标准化比值的影响机制主要取决于这些因素对华法林药效的影响[5]。华法林是香豆素类药物的一种，是维生素K拮抗剂，它通过竞争性抑制维生素K环氧化物还原酶起作用，使还原型维生素K不能合成。还原型维生素K的缺乏导致体内凝血因子Ⅱ、Ⅶ、Ⅸ、Ⅹ不能正常羧化，致使血液不能凝固[6]。有如下因素影响口服华法林的药效，进而影响凝血酶原时间（PT）及国际标准化比值（INR）。如患者的身高、体重、年龄的不同，导致华法林在体内代谢的程度不同，比如体重大的人所需华法林剂量增大，高年龄的人华法林肝代谢率下降，所需华法林的剂量减少，如果仍使用标准剂量可导致出血。此外饮食、吸烟、饮酒、合并用药（尤其影响肝药酶代谢能力的药物）对华法林最佳稳定剂量产生不同程度的影响[7]。饮食中提供维生素K的食物（如芹菜、韭菜、海藻、花椰菜等）会降低华法林的作用；饮酒及同期有肝功能不足会增加华法林的作用；当合并服用药物如氯吡格雷、辛伐他汀、优甲乐、苯溴马隆、尼麦角林、西咪替丁、红霉素、头孢菌素，大剂量的青霉素，中药如当归、银杏叶、连翘、丹参可影响华法林的药效。当合并甲亢、甲减、肾功能不全、腹泻时需严密监测患者的临床症状和INR。严重的腹泻可导致维生素K吸收不足，从而增加华法林的药效。
本试验选取口服头孢类抗生素、腹泻患者、长期饮酒的溶栓适应症患者，采集他们口服药物前后、腹泻治疗前后及戒酒前后标本，测定凝血酶原时间及国际标准化比值进行对比，表明这类因素对INR是有影响的。其中头孢类抗生素可直接降低维生素K依赖性凝血因子（Ⅱ、Ⅶ、Ⅸ、Ⅹ）的合成，而这些凝血因子参与内外源性凝血机制，使反应外源性凝血的PT延长，并使INR增高。其中腹泻的患者，一方面食物中维生素K无法正常吸收，另一方面肠道细菌（如大肠杆菌）无法合成维生素K，可导致体内的维生素含量减少，使华法林的药效增加，增加凝血酶原时间。其中长期饮酒的患者，引起肝功能不足，会增加华法林的作用，使凝血酶原时间和国际标准化比值增加。
3.2 溶血标本、标本量不足、未及时测定等对的凝血酶原时间的国际标准化比值的影响机制
标本采集不顺利、注入真空采血管中的血标本剧烈震荡或离心速度过大、时间过长都可造成标本溶血，标本溶血造成INR的降低[8]。其中标本量不足，造成抗凝剂与血液比例大于1∶9，相当于抗凝剂用量过大，造成PT和INR增高。而标本在室温放置时间过久，可导致凝血因子Ⅷ和Ⅴ对热不稳定，使凝血因子活性逐渐降低，使INR增高。
综上所述，影响凝血酶原时间的国际标准化比值测定结果的因素很多，无论是试验前还是试验中都要执行严格的质量控制，以保证检验结果的准确性，最大程度的为临床溶栓治疗提供合理依据。
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【摘要】 目的 观察虫草素对肿瘤坏死因子α(TNFα)刺激的离体大鼠血管平滑肌细胞(VSMCs)增殖和syndecan4蛋白表达的影响。 方法 体外培养大鼠胸主动脉VSMCs，分别应用终浓度为20 ng/mL TNFα、20 μmol/mL虫草素、40 μmol/mL虫草素、20 ng/mL TNFα+20 μmol/mL虫草素、20 ng/mL TNFα+40 μmol/mL虫草素作用24 h，并设对照组进行比较。采用MTS/PMS法确定VSMCs的增殖状态，利用Western blot蛋白免疫印迹法测定VSMCs中syndecan4蛋白的表达。结果 (1)与对照组比较，TNFα组能显著刺激大鼠VSMCs的增殖(P0.05)。TNFα联合虫草素共同作用组与TNFα组比较， VSMCs增殖均显著减少(P
【关键词】 syndecan4;虫草素;肿瘤坏死因子α;血管平滑肌细胞;细胞增殖
Abstract:Objective To investigate the effects of cordycepin on the proliferation of rat vascular smooth muscle cells(VSMCs)and expression of syndecan4 protein induced by tumor necrosis factorα(TNFα).Methods VSMCs were cultured in vitro and exposed to 20 ng/mL TNFα，20 μmol/mL cordycepin，40 μmol/mL cordycepin，20 μmol/mL cordycepin with 20 ng/mL TNFα，and 40 μmol/mL cordycepin with 20 ng/mL TNFα，respectively. All groups were treated for 24 h in vitro，in addition to the control group established for comparison. The ratio of proliferation of VSMCs was determined by nonradioactive MTS/PMS assay and the expression of syndecan4 protein was evaluated by Western blotting using antisyndecan4 antibody.Results (1) Compared to the control group，TNFα significantly stimulated the proliferation of rat VSMCs at the concentration of 20 ng/mL in TNFα group (P0.05)，but significantly inhibited VSMCs proliferation induced by TNFα (P
Key words:syndecan4; cordycepin; tumor necrosis factorα; vascular smooth muscle cells; cell proliferation
血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cells，VSMCs)增殖和表型改变是动脉粥样硬化(atherosclerosis，AS)的主要病理基础之一，动脉粥样硬化是对血管损伤的过度炎症反应。肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factoralpha，TNFα)是炎症反应的关键调节因子之一，可从多种不同的炎症细胞中释放，在动脉粥样硬化发生发展中起着关键的作用。Syndecan4是硫酸乙酰肝素(heparan sulfate，HS)类的跨膜转运蛋白多糖syndecans家族的成员之一。Syndecan4主要在血管平滑肌细胞上表达，它作为一种与生长因子结合的共受体(coreceptor)，调控着多种细胞生物学效应，在细胞的伸展、识别、黏附、迁移和增殖控制中扮演着重要的角色，同时也介导炎症反应[1]。虫草素(cordycepin)即3’脱氧腺苷，为含氮配糖体的核酸衍生物，为冬虫夏草的主要药理活性成分之一。研究表明虫草素具有抗炎和免疫调节等作用[2]。本研究观察了虫草素对TNFα诱导的大鼠血管平滑肌细胞增殖及syndecan4蛋白表达的影响。
1 材料与方法
1.1 主要材料
6周龄雄性SPF级SD大鼠，由南方医科大学实验动物中心提供(合格证号：SCXK粤20060015);DMEM培养基、0.25%胰酶均购自美国Gibco公司;胎牛血清(FBS)购自美国Hyclone公司;一次性96孔板购自美国Corning公司;TNFα购于美国Peprotech公司;虫草素购于美国Sigma公司(1108582002);CellTiter 96 Assay MTS/PMS试剂盒购于美国Promega公司(G5421);一抗为兔抗大鼠syndecan4多克隆抗体H140，购置于美国Santa Cruz公司(sc15350);二抗为羊抗兔IgG抗体，购置于英国Amersham公司(NA934);ECL化学发光试剂盒购于美国Pierce公司(JE120872);其余试剂均为国产分析纯。
1.2 VSMCs的原代培养
参考王道生贴块法[3]进行。取SD大鼠胸主动脉中膜，以贴块法培养于含10%(φ)胎牛血清的DMEM 培养基中，置于37 ℃、5%的CO2孵箱中培养。2～3周出现致密细胞层后即可传代，传代细胞呈典型的“峰与谷”样生长。细胞经使用抗αactin抗体鉴定为VSMCs，实验所用的VSMCs均为第3～6代传代细胞。
1.3 增殖评价
体外培养的SD大鼠VSMC在96孔板中以5 000个细胞/孔的密度铺板;8 h后，换成含1%FBS的DMEM培养基，维持48 h以获得同步的细胞生长停止;分别加入20 ng/mL TNFα、20 μmol/mL虫草素、40 μmol/mL虫草素、20 ng/mL TNFα+20 μmol/mL虫草素、20 ng/mL TNFα+40 μmol/mL虫草素。对照组为含5%FBS的DMEM培养基。24 h后细胞的增殖率通过应用96 Assay MTS/PMS试剂盒确定。用BioRad 550型Microplate Reader以490 nm波长测量吸光度(A)值，细胞的增殖率用A值表示。
1.4 Syndecan4蛋白免疫印迹测定
将体外培养的SD大鼠VSMCs分别用已配制好的试剂：20 ng/mL TNFα、20 μmol/mL虫草素、40 μmol/mL虫草素、20 ng/mL TNFα+20 μmol/mL虫草素、20 ng/mL TNFα+40μmol/mL虫草素刺激，对照组为5%FBS DMEM培养液。24 h后用DHanks液冲洗，冰上裂解细胞，收获蛋白。取适量待检测蛋白用SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳，将已分离的条带电转移到PVDF膜上，4 ℃封闭过夜，加入配置好的一抗(1∶200稀释)、二抗(1∶10 000稀释)孵育，用ECL化学发光试剂盒检测。βactin检测作为内对照。实验胶片用光密度扫描仪扫描，结果用图像软件BIORAD Quantity One分析。
1.5 统计学分析
各组A值用均数±标准差(±s)表示，用SPSS 16.0软件进行数据录入和统计分析。采用析因方差分析，两样本均数比较采用独立样本t检验;多组均数比较采用单向方差分析;组间多重比较，方差齐性采用LSD检验，方差不齐采用GamesHowell检验，P
2 结 果
2.1 虫草素对TNFα诱导的大鼠VSMCs增殖的影响
MTS/PMS法测定各组细胞增殖率分别为：对照组0.666±0.098，TNFα 20 ng/mL组1.013±0.150，20 μmol/mL虫草素组0.660±0.097，40 μmol/mL虫草素组0.676±0.085，TNFα 20 ng/mL联用20 μmol/mL虫草素组0.662±0.107，TNFα 20 ng/mL联用40 μmol/mL虫草素组0.627±0.135。统计分析结果表明，与对照组比较，20 ng/mL TNFα组能明显刺激大鼠VSMCs的增殖(P0.05)。20 μmol/mL虫草素联用20 ng/mL TNFα、40 μmol/mL虫草素联用20 ng/mL TNFα组与20 ng/mL TNFα组比较对VSMCs增殖均有明显的抑制作用(P
以目的蛋白对照组灰度值与内参对照组灰度值的比值为1，其余各组syndecan4蛋白表达量分别为：TNFα 20 ng/mL组1.375±0.017，20 μmol/mL虫草素组1.009±0.120，40 μmol/mL虫草素组1.002±0.050，TNFα 20 ng/mL+20 μmol/mL虫草素组0.962±0.057， TNFα 20 ng/mL+40 μmol/mL虫草素0.914±0.057(如图2) 。与对照组比较，TNFα组能明显刺激VSMCs的syndecan4蛋白表达(P0.05)。TNFα联合虫草素共同作用组与TNFα组比较对VSMCs的syndecan4蛋白表达均有显著抑制作用(P
3 讨 论
炎症反应贯穿于脑血管动脉粥样硬化的起始、病变进展及斑块破裂、血栓形成的全过程。TNFα是炎症反应的关键调节因子之一，TNFα主要由巨噬细胞产生， [JP+1〗与正常细胞相比， 在动脉粥样硬化病
Figure 3 Effects of cordycepin on syndecan4 protein expression in rat vascular smooth muscle cells induced by TNFα变中其表达上调，在动脉粥样硬化斑块局部的血管平滑肌细胞中发现有TNFα的mRNA表达。血管平滑肌细胞表面具有TNFα受体，是TNFα作用的靶细胞。TNFα与血管平滑肌细胞上的相应受体结合后可以促进细胞的有丝分裂过程。
研究表明，syndecan4在炎症及组织创伤愈合中发挥着重要的作用[4]。Syndecan4主要在血管平滑肌细胞上表达，其表达在动脉损伤早期即可增加，随后在7 d内减少到可控制的水平。在内皮组织裸露的动脉，血管中层平滑肌syndecan4的mRNA占整个血管壁的70%～90%。Rauch [5]等研究发现syndecan4是凝血酶诱导人VSMC迁移和增殖反应所必需的成分，凝血酶通过诱导sydnecan4蛋白的表达上调，从而激活p44/42 MAPK。Telci[6]等研究显示，在组织损伤修复中，syndecan4可与纤维结合蛋白转谷氨酰胺酶复合物结合，激活蛋白激酶Cα后，syndecan4聚集并与β1整合素结合，激活细胞存活机制及RGD依赖的细胞黏附，从而导致MAPK途径激活及肌动蛋白应力纤维形成。Houston[7]等报告了氧化型亚油酸能够刺激大鼠和人的VSMC增殖并上调syndecan4的表达。新近的研究提示，syndecan4作为一种重要的跨膜蛋白，是信号从细胞表面传导到细胞内部的重要传递者，也是细胞外信号引起细胞增殖反应的重要递呈者。位于细胞表面的syndecan4主要通过激活蛋白激酶Cα参与细胞的信号传导。在细胞因子等致动脉粥样硬化因素的刺激下，syndecan4通过硫酸乙酰肝素链与胞外的配体相结合，并调节其活性，经保守的跨膜区传导进入胞内，在其胞质尾区发生一系列的去磷酸化作用及寡聚化作用，使syndecan4与PIP2的亲和力增强，从而激活了蛋白激酶Cα，进一步激活了p44/42 MAPK，从而启动了大多数促细胞增殖的共同途径ERK途径。至于TNFα是如何影响syndecan4蛋白的表达，Zhang[8]等的实验证明了主要是通过两种机制来实现:一种是通过NFκВ介导的方式来增加syndecan4的基因表达;另一种是延长syndecan4mRNA的半衰期。
冬虫夏草是名贵中药材，具有多种药理作用，《本草从新》中记载：“保肺益肾，止血化痰，止劳嗽。” 冬虫夏草味甘、性平，归肺肾二经。主要功效为补肾阳、益肾精、补肺气、祛痰止咳、平喘。虫草素为冬虫夏草的主要药理活性成分之一，具有免疫调节作用、抗炎作用及抗肿瘤等作用。Zhou[9]等进行的体外实验证实虫草素能通过促进人外周单核细胞白介素10的分泌和白介素10 mRNA的表达来参与抗炎反应。De Jong [10]等发现虫草素能通过诱导调节性T细胞增殖来影响炎症反应。近年来发现，虫草素对转录因子NFκВ的抑制作用是其发挥抗炎作用的重要机制。NFκВ是合成蛋白的重要转录因子。虫草素抑制了NFκВ的从胞浆到核内易位和表达。在Kim [11]等的实验中，为了明确虫草素的抗炎机制，检测了脂多糖激活的RAW264.7巨噬细胞中Akt和MAP激酶的活性，在剂量依赖模式中，虫草素能显著抑制巨噬细胞中Akt和p38MAPK激酶的磷酸化，从而抑制了NFκВ从胞浆到核内的易位;除了通过抑制上述两种激酶而影响NFκВ外，虫草素还可以抑制转录因子抑制剂IκB alpha 的磷酸化，延长其降解时间。虫草素通过抑制NFκВ的作用，导致 iNOS和COX2基因表达下调，使NO产物的生成减少，最终的结果是抑制了炎症反应。YoungRae Lee[12]等人也证明了虫草素可以通过抑制NFκВ而完全限制了受紫外线激发的表皮成纤维细胞中MMP1和MMP3的表达。因此，可以推测虫草素通过影响众多细胞因子的表达而发挥抗炎作用，而它对NFκВ的抑制作用是其中关键的一环。本实验提示一定剂量的虫草素能够显著抑制TNFα诱导的VSMCs增殖和syndecan4蛋白表达。推测可能的机制是TNFα通过与VSMCs表面的相应TNF受体结合，使NFκВ的表达和易位增加，从而在基因水平使syndecan4蛋白的表达增加，随后激活p44/42MAPK信号传导通路，导致血管平滑肌细胞增殖，而虫草素可能通过阻断TNFα介导的NFκВ的易位和表达，从而使TNFα诱导的syndecan4蛋白的表达下降，减少蛋白激酶Cα的激活，从而进一步抑制p44/42MAPK的磷酸化，最终导致大鼠VSMCs增殖的减少。
综上所述，本研究表明一定剂量的虫草素能够显著抑制TNFα诱导的大鼠VSMC增殖和syndecan4蛋白表达。因此，有必要进一步研究虫草素抑制syndecan4蛋白表达的相关潜在靶点。
参考文献
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【摘要】 【目的】 观察当归补血汤含药血清对氧化低密度脂蛋白(OxLDL)激活小鼠单核细胞系RAW2647细胞中核转录因子κBp65(NFκBp65)mRNA表达的影响。【方法】将新西兰兔8只随机分为空白血清组和含药血清组，每组各4只，分别灌胃生理盐水和当归补血汤水煎液(剂量为84 g·kg-1·d-1)，分离血清。将RAW2647细胞悬液接种于培养瓶中，培养24 h，分为空白对照组、OxLDL组、PAR组(终浓度为10 μmol/L的小菊白内酯)、体积分数10%的含药血清组。除空白对照组外，其他各组分别加入100 μg/mL OxLDL刺激4 h，收集细胞。采用实时荧光定量PCR法检测各组细胞NFκBp65 mRNA的表达量。【结果】 OxLDL组与空白对照组比较，NFκBp65 mRNA的表达量增加(P< 005);含药血清组与OxLDL组比较，NFκBp65 mRNA的表达量减少(P< 005)。【结论】 当归补血汤含药血清能下调NFκBp65 mRNA的表达量，抑制、阻断NFκBp65的表达可能是当归补血汤抗动脉粥样硬化的作用机制之一。
【关键词】 当归补血汤/药理学;动脉粥样硬化/中药疗法;信号转导;基因表达调控;细胞培养
动脉粥样硬化(atherosclerosis， AS)是导致心脑血管疾病发生的重要病理改变，而氧化低密度脂蛋白(oxidized lowdensity lipoprotein， OxLDL)对AS的发生发展起着非常重要的作用。在动脉内膜下，低密度脂蛋白经氧化修饰成OxLDL，后者可以抑制低密度脂蛋白与其受体结合，抑制巨噬细胞的移动，致使局部OxLDL大量堆积，形成泡沫细胞，从而加速As的形成[1]。Brand等[2]发现AS病灶粥样硬化斑块内膜和中膜的平滑肌细胞及巨噬细胞、内皮细胞里均有活化的核转录因子κB(nuclear factorkappa B，NFκB)。NFκB可能是启动AS的关键因子[3]，由血管壁LDL的修饰到引发炎症和趋化因子的释放、内皮细胞黏附分子的表达等程序导致单核细胞向待损害部位聚集，NFκB都参与了其中[4-6]。当归补血汤目前已被广泛应用于AS及其相关疾病的治疗，疗效确切，具有降低血脂和抗氧化损伤的效应，能够明显减轻由OxLDL引起的单核细胞的趋化作用[7-9]。为探讨该方抗AS的作用机理，本研究观察了其含药血清对OxLDL激活小鼠单核细胞系RAW2647细胞中NFκBp65 mRNA表达的影响。现报道如下。
1材料与方法
11主要仪器及试剂BNA3210型CO2培养箱(日本ESPEC公司)，SWCJ1FD型超净工作台(中国苏州净化设备公司)，AXIOVERT 200倒置显微镜(日本ZEISS公司)，ABI3900台式高通量DNA合成仪(美国ABI公司)，ABI7300荧光定量PCR仪(美国ABI公司)，Sigma3k18型高速低温离心机(美国Sigma公司)，小菊白内酯(Parthenolide，PAR;美国Santa cruz 公司，批号：sc3523)，RPMI1640培养基(美国Invitrogen公司，批号：12491015)，胎牛血清(美国Invitrogen公司，批号：10099158)，逆转录试剂盒(中晶公司，批号：K1621)，总RNA提取试剂(Trizol Reagent，美国Invitrogen公司，批号：15596026)。
12实验动物健康新西兰大耳白兔共8只，由广州中医药大学实验动物中心提供，许可证号：SCXK(粤)20030001，雌雄各半，3～4月龄，体质量15～20 kg。
13当归补血汤水煎液的制备黄芪、当归均使用道地药材，为甘肃产品，购自广东省药材公司并加以鉴定。按照《内外伤辨惑论》原方中黄芪和当归以质量比5∶1的配伍比例称取生药，以每g生药加水6 mL，冷水浸泡30 min，煮沸后再文火慢煎40 min，趁热过滤，滤液自然滴尽，第2煎按每g生药加水4 mL，煎法同前，合并滤液，95 ℃水浴浓缩成含生药084 g/mL的水煎液，4℃保存。
14血清制备8只兔随机分为空白血清组和含药血清组，每组4只，分别灌胃生理盐水和当归补血汤水煎液，实际灌胃剂量按动物体表面积换算得出，临床等效剂量为168 g/kg，按每kg体质量每天灌胃量为5倍临床等效剂量即84 g·kg1·d1，连续灌胃3 d，第4天上午于禁食12 h后灌胃1次，1 h后乙醚麻醉动物，无菌条件下心脏采血，将抽取的血液室温下静置3 h，离心，取上清，56 ℃水浴中灭活，022 μm微孔滤器过滤除菌，-70 ℃保存备用。
15细胞培养将RAW2647细胞培养于含体积分数10%胎牛血清的RPMI1640培养液中，置于37 ℃ 、体积分数5% 的CO2培养箱中培养，2 d换液1次。细胞长满单层后可传代，用25 g/L的胰酶乙二胺四乙酸消化处于生长旺盛期的单层培养细胞，再用含体积分数10%胎牛血清的RPMI1640培养基终止消化，1 000 r/min离心5 min，收集细胞，制成细胞悬液，细胞计数，调整细胞密度为3×104 /cm2，再培养。
16实时荧光定量PCR法检测RAW2647细胞中NFκBp65 mRNA的表达量从Gen Bank上查找和对比目的基因，设计引物：Mouse GAPDH：上游引物5AACAGGGTGGTGGACCTCAT3;下游引物5GGGATAGGGCCTCTCTTGCT3。Mouse NFκBp65：上游引物5ACGCGGATTCCTGTACACCT3;下游引物5CAGGAGCTCCACAGGACAGA3。合成引物。
17实验分组及处理实验分为空白对照组、OxLDL组、PAR组、含药血清组。调整细胞悬液密度5×104/cm2，按分组接种于24孔板中，每组4个复孔。在37℃ 、体积分数5% CO2饱和湿度下培养24 h。弃去原培养液，以磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤细胞2～3次。空白对照组、OxLDL组加含体积分数10%空白血清的RPMI1640培养液孵育24 h;PAR组加含体积分数10%空白血清的RPMI1640培养液孵育24 h，再加入终浓度为10 μmol/L PAR预处理2 h;含药血清组加含体积分数10%含药血清的RPMI1640培养液孵育24 h。除空白对照组外，其他各组分别加入100 μg/mL OxLDL刺激4 h。抽提RNA：弃原培养液，不洗，每孔各加500 μL 总RNA提取试剂，吸打混匀。室温静置5 min。加100 μL氯仿，剧烈震荡15 s。室温静置5 min。4℃、12 000 r/min离心15 min，此时溶液分为3层，取上清液，移至新离心管中，加250 μL异丙醇，混匀，室温静置10 min。4℃、12 000 r/min离心8 min。弃上清，加入500 μL 体积分数75%乙醇洗沉淀，4℃、12 000 r/min离心5 min，风干5 min。焦碳酸二乙酯(DEPC)溶解沉淀，-70℃保存。逆转录反应：加RNA样品11 μL，六聚物引物1 μL入PCR小管，吸打混匀。放入PCR仪中，70℃、5 min。取出加入5倍反应缓冲液4 μL、RNA酶抑制剂1 μL、三磷酸脱氧核糖核苷(dNTP) 混合液 2 μL，吸打混匀。放入PCR仪中，25℃、5 min。取出加入逆转录酶1 μL，吸打混匀。放入PCR仪中，25℃、10 min，42℃、60 min，70℃、10 min。荧光定量PCR反应：准备96孔板，按上述分组，每组各4个复孔，25 μL反应体系，依次加入蒸馏水101 μL、荧光染料混合液125 μL、上游引物02 μL、下游引物02 μL、样品溶液2 μL。吸打数次混匀，稍离心。放入PCR仪，95℃、15 s，60℃、60 s，进行40个循环。反应结束后，由电脑自动分析并根据标准曲线计算样品及内参的基因拷贝数。
18统计学方法结果以鸭乙肝病毒为标准品，计算样品目的 mRNA拷贝数与内参照三磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH) mRNA拷贝数的比值进行统计分析。数据采用SPSS 130 软件包进行统计分析。
2结果
RAW2647细胞NFκBp65 mRNA表达的变化：各组溶解曲线峰值较集中，未出现非特异性扩增(图1-c、图2-c，彩图见第556页)。各组内参照GAPDH cDNA扩增循环数较集中，提示各组样品浓度较接近(图2-b，彩图见第556页);各组NFκBp65 cDNA扩增循环数差距明显(图1-b，彩图见第556页)，提示各组NFκBp65 mRNA表达量有明显差异。表1结果显示：OxLDL组与空白对照组比较差异有显著性意义(P
3讨论
NFκB通路是一条重要的细胞内信号转导通路，参与了多种生理病理过程的调节。其与AS的发生发展关系密切，已成为国内外学者进行抗AS研究所高度重视的一个药理学作用靶点。OxLDL首先激活NFκB上游激酶，引起级联反应，最终活化NFκB，使其转入核内，引起相关基因的表达，启动一系列炎症因子的基因转录，而炎症因子的过度表达又会加重NFκB的活化[10]。NFκB家族成员以不同组合形成异源二聚体，每一个NFκB蛋白均有特殊的作用，其中p65/p50异聚体在大多数哺乳动物细胞中大量存在，p65含有强转录激活结构域，与AS的发生发展关系密切[11]。因此，本实验观察了当归补血汤含药血清对OxLDL诱导的RAW2647细胞中p65 mRNA表达的影响，探讨当归补血汤是否通过NFκBp65起到抗AS作用。本实验结果表明：OxLDL可明显激活RAW2647细胞中的NFκB通路，当归补血汤含药血清能下调NFκBp65 mRNA表达。
综上所述，在AS发生的早期脂质浸润、泡沫细胞形成过程中，NFκB通路发挥着重要作用，当归补血汤可能通过调节该通路以调控相关致炎因子的表达进而影响AS的发生发展，抑制、阻断NFκB信号转导通路可能是当归补血汤抗AS损伤作用的机制之一。
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愉快的暑假到了，为了使自己的假期生活过的健康充实，欢乐而有意义，我特别为自己的暑假生活制定了具体的计划。我的计划大概分为两个方面：学习计划、生活计划。
第一，学习计划，具体如下：
1.争取7月1日至7月20日完成语、数、外三门暑假作业。计划大概每天完成6面暑假作业。
2.预习语文六年级上册的古诗词，文言文，日积月累等等。并有重点的选择背诵。
3.预习六年级上册数学相关内容。
4.预习六年级上册英语的课程，默写有关单词，听磁带。
5.每天看课外书，报纸，还可以看看动画片，但时间不能太长。
6.写暑假日记一本，作文10篇，练好钢笔字。
第二，生活计划具体如下：
1.培养个人的生活能力，比如：做饭、洗衣服。帮父母干一些力所能及的家务活，扫扫地，给父母捶捶背，帮父母买点东西等等。
2.要注意个人安全等方面问题，不私自下河游泳，不能私自外出，不做危险违法的事。
3.要每天锻炼身体，坚持跑步，每个星期天去爬一次山。每个星期六去游泳馆游泳一次。每天还要早起，不睡懒觉。如果父母不在家，不能给陌生人开门，不跟陌生人讲话.。见人要有礼貌。
这就是我的暑假计划，我相信只要认真执行这些计划我就一定能过一个美好，愉快的暑假!
小学生暑假计划【2】
一、时间安排
1、每天的四个“1小时保障”
每天保障做一小时的语文或数学寒假作业;
每天保障一小时的无负担课外阅读;
每天保障一小时的英语自学;
每天保障一小时的户外活动或运动。
2、计划与非计划
如无特殊情况，每天必须完成以上计划;
每天的计划在得到“保障”的前提下，可灵活自由安排;
如果因外出旅游、回乡下度假等意外安排，可临时不予执行;
可以偶尔睡懒觉，但不要影响当日计划的实施。
二、学习计划
1、不参加语文、数学的培优，不请家教，相关课程自己独立完成。
2、语文课程计划
7月份完成暑假作业，8月中旬前检查、改正，查漏补缺;
把自己的藏书系统再读一遍，重点读历史、百科知识大全、漫画、中外名著导读等丛书;
假期可以自己买三本自己喜欢的任何书籍;
把以前稍显薄弱的阅读题的规范回答、错别字系统复习。
3、数学课程计划
7月份完成暑假作业，8月中旬前检查、改正，查漏补缺;
假期完成五年级《奥数提高班》的自学，基本掌握其要领，有选择性挑选典型题目做。
自己注意计算细心化的纠正。
4、英语课程计划
英语学习能力和成绩一般，要重点加强学习兴趣和能力的培养;
把三年级和四年级的学校课本系统复习一遍，每天坚持听剑桥英语的磁带，时间不限;
假期把以前记得的英语单词都记在小本子上，分类汇总;
若有兴趣、有机会，可以把语音和音标接触、巩固一下，尽量保证发音标准。
三、活动安排
1、随父母至少省内出去旅游一次，争取省外旅游去一次;
2、至少去乡下亲戚家2次，体验生活，其中爷爷家族亲戚去一次，外公家族亲戚去一次;
3、每天保障一小时的户外活动或运动，散步、溜冰、找小朋友玩等，要注意安全;
4、每两天至少帮家里做一件家务事(10分钟以上)，洗衣服、择菜、简单做饭等;
5、一个人尝试独立在家呆1-2天;邀请同学或者小朋友在家玩若干次，并独立招待;
6、每周玩电脑2小时左右，重点加强打字能力的提高;
暑假到了，妈妈为了挖掘我的英语潜力，和我共同制定了学习计划：天背两个单元的单词并默写。自从计划开始以后，我的社会便变得忙碌起来。
妈妈先教我学习音标。再教我26个英文字母，我经常把英文字母里的“r”语滨拼音里的“a”弄混。妈妈便让我从前往后默写，还打乱顺序给我听写我终于能熟练地掌握26个英文字母的大小写了。
接下来该背单词了。开始我很盲目，读十几遍都背不过，心里想：就这么一个小小的单词便让我苦恼，那后面那么多单词，我那年那月才能背过呢？我急的都快哭出声了。妈妈走过来，语重心长地对我说：“崔煜东，你怎么了？”我说：“我记不住英语单词！”妈妈说：“没关系，我来教你怎么记。”妈妈先在所有的单词上注上音标，再把方法告诉我：比如but这个单词，“b”发“／b／”的音，“u”发／a／的音，“t”发／t／的音。连起来读就是／bat／拼写就是but。
自从用了妈妈教我的方法，我背单词快多了。备课文、默写课文也流利多了，每次都顺利通过妈妈的检查。现在又有一个好朋友魏志远加入了我的队伍。
虽然英语占用了我很多的时间，但是我乐意，因为IlikeEnglishverymuch！
考研英语词汇app较好的有：
1、考研词汇速记：可以智能制定学习计划，有词汇分组，单词扩展，以及例句，更利于记忆。支持音标显示、语音朗读，智能循环记忆。词义缓出，先单词再中文，是方便易用的单词软件；
2、英语方舟考研：智能提供适合你的单词列表，只背不会的单词，节约学习时间，提高学习效率；
3、沪江开心词场：科学的MAP记忆法提供全方位单词记忆，让背词效果更好，效率更高。可以随时和微信及QQ里面的好友进行单词PK。生词本提供多种便捷复习方式巩固记忆。
（来源：文章屋网 ）
1、每天的四个“1小时保障”
每天保障做一小时的语文或数学寒假作业。
每天保障一小时的无负担课外阅读。
每天保障一小时的英语自学。
每天保障一小时的户外活动或运动。
2、计划与非计划
如无特殊情况，每天必须完成以上计划。
每天的计划在得到“保障”的前提下，可灵活自由安排。
如果因外出旅游、回乡下度假等意外安排，可临时不予执行。
可以偶尔睡懒觉，但不要影响当日计划的实施。
二、学习计划
1、不参加语文、数学的培优，不请家教，相关课程自己独立完成。
2、语文课程计划。
7月份完成暑假作业，8月中旬前检查、改正，查漏补缺。
把自己的藏书系统再读一遍，重点读历史、百科知识大全、漫画、中外名著导读等丛书。
假期可以自己买三本自己喜欢的任何书籍。
把以前稍显薄弱的阅读题的规范回答、错别字系统复习。
3、数学课程计划。
7月份完成暑假作业，8月中旬前检查、改正，查漏补缺。
假期完成五年级《奥数提高班》的自学，基本掌握其要领，有选择性挑选典型题目做。
自己注意计算细心化的纠正。
4、英语课程计划。
英语学习能力和成绩一般，要重点加强学习兴趣和能力的培养。
把三年级和四年级的学校课本系统复习一遍，每天坚持听剑桥英语的磁带，时间不限。
假期把以前记得的英语单词都记在小本子上，分类汇总。
若有兴趣、有机会，可以把语音和音标接触、巩固一下，尽量保证发音标准。
三、活动安排
1、随父母至少省内出去旅游一次，争取省外旅游去一次。
2、至少去乡下亲戚家2次，体验生活，其中爷爷家族亲戚去一次，外公家族亲戚去一次。
3、每天保障一小时的户外活动或运动，散步、溜冰、找小朋友玩等，要注意安全。
4、每两天至少帮家里做一件家务事（10分钟以上），洗衣服、择菜、简单做饭等。
5、一个人尝试独立在家呆1-2天。邀请同学或者小朋友在家玩若干次，并独立招待。
6、每周玩电脑2小时左右，重点加强打字能力的提高。
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