时间：2023-03-06 15:57:39
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承包人： (以下简称乙方)
依照《中华人民共和国合同法》、《中华人民共和国建筑法》、《建设工程质量管理条例》及其它有关法律、行政法规，遵循平等、自愿、公平和诚实信用的原则，双方经协商一致订立本协议。
第一条：工程概况
工程名称： 住宅套内及公共区域装修工程。
一、工程地点：
二、工程内容：乙方负责按甲方确认的施工图纸及相关设计变更通知对 住宅室内、首层电梯大堂及电梯间、标准层电梯间装修工程。
其它工程内容：
第二条：承包范围及承包方式
一、承包范围： 室内、首层电梯大堂及电梯间、标准层电梯间精装修工程的施工。具体内容包括各区域地面、天棚、墙面的装修，入户门、室内护窗栏杆制安、卫生洁具、卫生间挂件、橱柜、地柜、开关插座、灯具、抽油烟机、煤气炉、消毒碗柜安装等。
其它内容： 。
不包含在本工程承包范围的毛坯房和已施工的样板房：
二、承包方式：包人工、包材料、包机械、包损耗、包工期、包质量、包安全、包文明施工、包市场风险、包验收合格、包税金的形式承包本项目。
三、乙方须按甲方的要求，提供报建相关的资料，并配合甲方进行报建的相关工作，如因乙方原因影响甲方报建及验收的进度，由此增加的费用由乙方负责。
四、其它约定：
第三条：工程质量标准
质量标准按国家、地方现行相关规范及通用条款第9条执行,并达到合格。
第四条：验收及移交
按照本合同通用条款第12条以及协议书第三条、第七条的约定进行验收。
第五条：质量保修期
本合同防水工程保修期为五年，室内装修工程的质量保修期为两年。其余未提及的均按照通用条款第13条执行。
第六条：合同工期
一、开工日期：开工时间暂定为 年 月 日开工，具体开工日期以甲方现场管理代表签发的开工令确定的开工日期为准。
二、合同工期：(下列几项根据项目实际情况选择填写)
总工期： 日历天
工程分批进场施工，每批工程工期： 日历天
单栋工期为： 日历天
节点工期：
三、竣工日期： 具体竣工日期以甲方现场管理代表签发的开工令日期及合同总工期确定。
各楼栋竣工日期：
四、节点工期要求：甲方可以根据现场的施工条件，合理安排本合同工程项目进行分段施工，乙方应按甲方现场管理代表下发的分段施工指令组织施工。
第七条：材料的供应及计价
一、由乙方自行选择供货商进行采购的材料由乙方在签订合同前按照甲方确认的设计图纸要求注明的颜色、质量、质感、规格、品牌送实物样品供甲方确认，经甲方确认后，作为实物样板封存，并由乙方按甲方确认的实物样板自行采购。
二、乙方应根据材料需进场的时间，在图纸下发后7天内，以书面形式提交属于代供代扣代付的材料进场计划报工程师审核，计划须包含品种、规格、等级、数量、品牌及进场时间等内容。如设计变更需取消原材料计划，应在变更下发后3天内通知甲方(代供代扣代付材料已按计划进场后，因甲方设计变更所导致的相关责任均由甲方承担)。如因乙方未及时提交代供代扣代付材料进场计划或提交错漏计划，导致甲方不能及时进行代供代扣代付材料采购或采购错漏时，一切不利后果均由乙方自行承担。若代供代扣代付材料的进场未满足乙方提交的材料进场计划的要求，属甲方原因所造成的损失和因此延误的工期责任经甲方确认后，由甲方承担;
三、代供代扣代付材料由甲方负责运到工地，乙方在送货单上核对并签认，并由乙方负责代供代扣代付材料的卸车、场内运转、清点、验货、接收、保管、切割磨边加工等一切后续工作，以上工作(包括期间的损耗、损失)涉及的费用已包含在合同价中，甲方不另行支付费用。
四、甲方代供代扣代付材料的品牌、型号、价格以施工现场收货单为准，甲方代供代扣代付材料的价格按本合同附件 及附件 《甲方代供代扣代付材料单价清单》。甲方代供代扣代付材料的总损耗率见本合同附件 ～附件 、附件 ～附件 ，本合同附件 ～附件 、附件 ～附件 的总损耗率结算时不作调整。乙方领用甲方代供代扣代付材料的总数量=施工项目工程量×(1+总损耗率)，超出此数量范围的甲乙双方重新核定后乙方方可领用，超出部分的材料费用(含采保费和税金)由乙方承担。
五、所有代供代扣代付材料的送检由乙方负责，检测费用由甲方承担，乙方先行垫付，由甲方现场管理代表在相关收费票据上签字确认后与最近的进度款一并支付。
六、代供代扣代付材料送检不合格所造成的一切后果由甲方承担，且延误的工期相应顺延。
第八条：合同价
一、暂定总价(含甲方代供代扣代付材料)：人民币 (￥ 元)。
二、计价方式
1、住宅套内装修工程(不包括： )
(1)采用每平米套内面积单价包干的方式，具体每个户型的每平方米套内面积包干单价见本合同附件 。每个户型的每平米套内面积包干单价的造价分析见本合同附件 ～附件 。
(2)工程量的计算：根据施工竣工图按实际完成工程量计算。结算按实际完成户型的套内面积乘以对应户型的合同单价结算。套内面积计算规则为：各套公用墙(包括各套之间、各套与公共建筑间的分隔墙及外墙)的中心线所围的水平投影面积计算(中心线以外的飘窗台面积不计算装修面积);阳台装修面积(含封闭阳台)按水平投影净面积(不含外墙)的一半计算，露台不计算面积。
(3)套内面积包干单价已经包含了该项工程项目施工图中所有的及施工图中没有说明但在施工过程中为完成该项工程必须完成的所有工作，如该项工程描述存在漏项、测误亦视为已经包含在该项包干单价中，不得另增加费用。
(4)住宅套内面积包干单价不含入户门、入户门槛石、弱电的管线(除有线电视线外)及插座面板(除宽频电视插座外)、入户总电箱等。其它不包含内容：
2. 公共区域装修工程(包括首层入户大堂及首层电梯间、标准层电梯间，其它包含的内容： )
(1)采用含税单项单价包干方式。具体的包干单价详见附件 ～附件 、附件 ～附件 。
(2)计算规则为：各单项子目按实际发生工程量结算。
(3)单项包干单价已经包含了施工图或报价清单中没有说明但在施工过程中为完成本项工程必须完成的所有工作，如有测误亦视为已经包含在清单包干价中，不得另增加费用。
3、按以上计价方式计算的工程造价包含的内容：人工费、机械费、材料费(含代供代扣代付材料的卸车、场内运转、清点、验货、接收、保管等一切后续工作所发生的费用在内)、搭拆脚手架工料费用、石材磨边、材料加工(含甲供块料加工)、开槽、防污、防水、以及幕墙防污防腐防火防水防雷、钢型材除锈防腐费、吊装费、工程及材料(乙方自行采购的材料)所须的各种检测费及试验费(包含幕墙的“四性”试验检测费和实验的试件材料费及安装人工费)、各种材料损耗费、卸车费、材料场内二次运输费、负责其它专业承包人施工收边收口产生的费用、技术处理费、保管费、合同工期内的赶工费、施工水电费、技术措施费、已完工程及设备保护措施费、安全文明施工费、雨季或异常气候施工措施费、成品保护费、垃圾清运到甲方指定地点堆放费用、工程完工验收前清洁费、远程施工增加费、现场经费、综合管理费、利润、税金及其他一切费用。
4、包干单价不含主体配合费，由甲方另行支付给主体单位。
5、主体单位的配合内容为：详见第十一条
6、若由甲方提供水、电源，则水电费按甲方实际代缴数额由甲方从乙方的每一次工程进度款中扣除。
7、乙方负责其它专业(土建专业除外)的楼板或墙体穿洞的收边收口等工作，此部分费用包含在清单包干价中，甲方不予另行签证。
8、甲方只负责提供施工现场堆放材料的场地，乙方自行解决施工及管理人员住宿办公场所，甲方不予补偿费用。
9、甲方只提供现有的垂直运输设备;若装修单位在主体单位拆除垂直运输设备后进场，则由装修单位自行解决运输问题，相关费用已包含在合同价格中;装修单位不准使用客梯进行运输。”
10、乙方进场前，由甲方组织乙方、总包定位、监理单位对土建、装饰施工界面进行勘测、交验、核对，并形成书面文字备案;若甲方未及时组织四方进行界面交验，因此造成工期延误的，经甲方确认后，可以顺延工期。
三、调价方法：
(一)住宅套内装修工程
1、除甲方原因引起的设计变更、甲方代供代扣代付材料变更外，本合同执行期间，面积包干单价不因任何因素而作调整。若因甲方设计原因引起的设计变更，本合同附件 ～附件 已有的项目按合同附件 ～附件 的项目单价执行，合同附件 ～附件 外的项目，由双方协商对变更部分的造价增减进行约定。
2、若因甲方原因变更甲方代供代扣代付材料，则附件 ～附件 栏目中除主材基价按双方签字确认的工地收货单上的价格调整外，其它费、取费表不作调整，甲方代供代扣代付材料总损耗率除材料规格变化外其他因素发生变化不作调整
(二)公共部分装修工程
1、除甲方原因引起的设计变更外，本合同执行期间，包干单价不因任何因素而作调整。若因甲方设计原因引起的设计变更，本合同附件 ～附件 已有的项目按合同附件 ～附件 的项目单价执行，合同附件 ～附件 外的项目，由甲方签证，双方协商签订补充协议，对变更部分的造价增减进行约定。
2、若因甲方原因变更甲方代供代扣代付材料的品种、规格或者价格时，则附件 ～附件 栏目中除主材基价按双方签字确认的工地收货单上的价格调整外，其它费、取费表不作调整，甲方代供代扣代付材料总损耗率除材料规格变化外其他因素发生变化不作调整。
(三)本合同适用于下列第 种情况
第1种情况：本合同附件 ～附件 中的组成套内装修单元面积包干单价的“各户型单套工程量”和附件 的“单套套内面积”及附件 ～附件 、附件 ～附件 中甲方代供代扣代付材料中的抛光砖和瓷片的“材料总损耗率”为暂定，待详细图纸下发后1个月内双方根据施工图纸重新核对“各户型单套工程量” 、甲方代供代扣代付材料中的抛光砖和瓷片的“材料总损耗率”和“单套套内面积”，并根据核对后的结果以补充协议书的形式调整本合同造价。(本条适用于未出详细图纸情况)
第2种情况：本合同附件 中的组成套内装修单元面积包干单价的“各户型单套工程量”和附件 的“单套套内面积”已核对完毕，除甲方原因引起的设计变更、甲方代供代扣代付材料价格变更及甲方代供代扣代付材料中的抛光砖和瓷片的“材料总损耗率”变更外，本合同执行期间，各套内户型清单子目数量及面积包干单价不因任何因素而作调整。(本条适用于已出详细图纸情况)
第九条：付款时间、条件与付款方式
一、合同签订，乙方进场施工后7天内，甲方支付乙方合同暂定总价并扣除甲方代供代扣代付材料款、 后金额的10%作为工程备料款。若工程分期分批施工，甲方按分期分批施工部分 合同暂定价扣除甲方代供代扣代付材料款后金额的10%作为工程备料款。
其它约定：
二、乙方每30天申报一次进度款，经核实后7天内甲方按乙方当期实际完成工程量金额(含签证)扣除已使用(包括损耗)的甲方代供代扣代付材料款后的70%作为工程进度款，当期领用但未使用的甲方代供代扣代付材料的款项应在领用之日起第60天后申报的第一笔进度款中按70%的比例扣除完毕，不足扣的在下一笔进度款中扣完，在最后一次进度款中，扣除乙方已领用的全部甲方代供代扣代付材料款(含乙方库存部分)的剩余金额，进度款不足抵扣的,在结算款中扣除。
即：当期实际支付的进度款=(当期实际完成工程量金额-当期使用(包括损耗)的甲方代供代扣代付材料款-当期满足扣减条件的领用但未使用的甲方代供代扣代付材料款)×70%。
三、工程竣工验收合格，承包人应在30天内向发包人递交竣工结算报告及相关资料，办理结算后30天内，甲方累计支付乙方至实际工程结算价的97.5%，甲方应支付的款项应扣除甲方代供代扣代付材料款、工程备料款、工程进度款、 。
四、工程结算价的2.5%作为保修金，待工程竣工验收合格满两年后如无质量问题、无发生甲方代扣代付维修费用，则甲方在30天内无息支付2.3%，其余0.2%待防水工程五年质保期满后如无质量问题、无发生甲方代扣代付维修费用，则甲方在30天内无息付清保修金。
五、乙方在领取每一次工程款时须向甲方提交建安发票，发票金额为包含甲方代供代扣代付材料在内的装修造价，甲方同时向乙方提交甲方代供代扣代付材料等额材料发票，乙方向甲方开具的工程发票的累计金额为含甲方代付代扣材料款在内的工程总价。
第十条：现场移交标准
场地移交标准：
1、内墙抹灰、卫生间沉箱回填及找平完成。
2、垃圾清理干净，楼面不得留有浮渣。
3、
第十一条：施工配合和总包服务内容
1、总承包单位提供现有室内外垂直运输及室外脚手架供乙方运输材料、设备、机械(大、中型设备、机械除外)，乙方对垂直运输设备的使用须服从甲方的整体安排，乙方须对室内垂直运输设备进行保护，由乙方承担因室内垂直运输设备保护不利造成的损失
2、总承包单位负责施工垃圾及余泥外运。乙方将垃圾及余泥堆放至总承包单位指定的地点(但甲方与总承包单位指令出现矛盾的，以甲方的为准)，由总承包单位负责外运;若发现乙方的建筑垃圾乱堆放，作业面清理不到位，在甲方工程师的见证下,总承包单位有权派人将作业面清理，对于所发生的人工、机械等费用，甲方可以在乙方当期进度款中转扣给总承包单位。
3、总承包单位每栋每单元提供水电源点(如不能提供水电源点,也可按总承包单位现有水电源点情况适当提供,但须满足本工程施工接取水电源的需要)，乙方需自行安装水表、电表并承担水、电费(须分摊总表线路损耗)，将由乙方自行缴交给主体施工总承包人。
4、总承包单位及时提供装修工作面以及符合要求的标高线(水平线)及轴线(垂直线)。
5、乙方进场施工时，在甲方或委托的监理组织下，乙方应与总承包单位办理场地移交手续，以明确所移交场地的范围、条件及相互责任。
6、总承包单位负责土建修补工作，因乙方原因而需要重复打凿所产生的修补或由于乙方的错误而导致的返修、返工等引起的修补，由乙方自行修补并承担费用。
7、乙方在进场前，须与总承包单位签订文明施工、安全生产协议书及临水临电供应协议书，否则，总承包单位有权拒绝乙方的进场，导致的工期延误及其他损失，全部由乙方承担。
8、乙方所有临时建筑物、构筑物、排栅、场地等，应按经甲方批准的施工组织设计进行搭建(施工现场不许搭建生活设施)。在施工过程中一旦发生临时设施需要拆除或迁移时，乙方应服从并负责拆除或迁移，其费用已综合考虑在合同价中，不另计取。
第十二条：双方现场代表
一、甲方授权 为现场管理代表，监督检查工程质量、进度、负责设计图纸的变更，工程期间的质量验收及其他事宜。
二、乙方委派 为项目经理。委派的项目经理须持有与工程项目相适应的真实有效的资格证书，负责施工期间的施工质量、安全等问题。
三、乙方应至少任命一位称职的一级项目经理(或一级建造师)常驻工地，作为负责施工管理和合同履行的代表，此项目经理的人选必须经甲方审批。
四、乙方委派的项目经理、技术负责人须持有与工程项目相适应的真实有效的资格证书，项目经理须从事同类专业工程施工管理工作经历5年以上，并具有同类工程施工经验，负责施工期间的施工质量、安全等问题。甲方任何发给此项目经理的指令将视为已有效地发给乙方。技术负责人须具有中级或中级以上技术职称，并具有同类工程管理经验。
五、在正常工作时间内，乙方项目经理、技术负责人每天离开工地现场超过4小时，必须向甲方驻现场代表请假并获得批准后方可离开;乙方项目经理离开期间，乙方项目副经理或技术负责人履行项目经理的义务。
六、乙方项目经理、技术负责人每个月累计离开现场时间不得超过三个日历天;项目经理、技术负责人当月累计离开现场时间超出三天的，每超出一天，乙方承担5000元的违约金，此后每天的违约金按20xx元递增;施工过程中，甲方有权力指令乙方撤换不能胜任、玩忽职守的项目管理人员(包括项目经理、副经理及施工管理人员)或班组，乙方必须服从并执行。
七、乙方派驻本工程项目的管理人员名单见合同附件，乙方未经甲方同意不可更换项目经理、项目副经理或技术负责人，否则乙方应向甲方支付违约金5万元/人，同时甲方保留单方解除合同的权利，特殊情况须经甲方同意。甲方在施工现场设立指纹考勤机对项目管理人员进行考勤管理。
第十三条：其他约定
一、乙方在投标过程中已仔细察看过招标样板，并熟知甲方对相关的材料的要求，如乙方提供的材料样板无法达到甲方的要求，乙方承诺按照甲方提供的招标样板施工，相应项目的综合单价不作调增。
二、本合同签订后3个日历天内，乙方应向甲方提供合同暂定总价 0.5%的履约保证金或 3% 的履约银行保函。乙方未依本约定提供履约保证金或履约银行保函的，甲方有权从乙方的任何一笔工程款中抵扣。
三、乙方必须做好现场已完工项目成品保护工作，重点做好入户门、地毯、地板、石材地面部分完工项目成品保护工作，若成品保护措施不到位出现问题，乙方需无条件服从甲方要求整改、修复或赔偿甲方委托第三方单位修复费用。
四、在工程施工过程中，若甲方要求增加施工人员，则乙方应无条件按甲方要求执行。由此而增加的费用已在相应的单价中综合考虑，该部分费用不另行增加。
五、乙方在工程竣工验收时，应按甲方要求，向甲方提供符合国家城建档案管理部门的要求规格编制成册的工程竣工图及有关的技术文件档案资料，并确保通过建设工程档案专项验收，取得符合验收备案要求的《建设工程档案验收意见书》。
六、乙方必须为从事危险作业的职工办理意外伤害保险，并为施工场地内自有人员生命财产和施工机械设备办理保险，支付保险费用。
七、乙方承诺就甲方代供代扣代付材料与甲方及代供代扣代付材料供应商签订《代付代扣材料物资款三方协议》，此合同作为甲方受乙方委托代供代扣代付材料物资款给代供代扣代付材料供应商的依据。
八、代供代扣代付材料供应商每月收到乙方委托甲方代付的材料物资款后，代供代扣代付材料供应商应于收款时开具等额发票给乙方，此发票由甲方转给乙方。
九、乙方认同《民工权益保障承诺书》内容，并作出慎重承诺，具体内容详见：附件。
十、甲方通讯地址: ，邮政编码为： ，乙方依本地址向甲方发送有关信函文件，甲方如变更上述地址应及时通知乙方，避免发生延误。
十一、乙方通讯地址： ，邮政编码为： ，甲方依本地址向乙方发送有关信函文件，因乙方所留地址有误或变更地址未通知甲方的责任由乙方承担，甲方向乙方所发送的信函文件等视为已送达乙方。
十二、乙方负责清除和外运在施工过程中产生的一切垃圾，包括设计修改、增加工程产生的垃圾，按甲方的要求将垃圾堆于工地内自然地面上的指定地点。工程竣工前负责完成场地清理(包括建筑物周围的余泥及其他堆积物，临时的施工和生活设施拆除)。乙方须在甲方要求时间前完成场地清理，逾期未完成，甲方有权自行处理，乙方承担一切费用。
十三、双方当事人在自愿、平等的基础上对“通用条款”进行了协商。乙方对于“通用条款”的修改意见，已经完整地包括在本协议书中。双方自愿遵守“通用条款”中未修改的部分和本协议书。
十四、如甲方工作人员明示或暗示要求宴请、招待，或索取礼金、礼品、礼券、其他利益，或故意刁难、显失公平现象，乙方可以向甲方监察部门进行举报。
十五、其它约定：
第十四条：合同生效
一、本合同自双方签字盖章后生效。
二、本合同文本壹式肆份，甲方、乙方双方各执贰份，各份具同等法律效力。合同发生纠纷协商不成时，双方约定由工程所在地人民法院裁判。
发包人(盖章)： 承包人(盖章)：
签约代表： 签约代表：
承包方：_________，简称乙方；
企业经营者：_________。
甲、乙双方根据_________，经协商签订本合同。
一、承包形式
上缴利润定额包干，超额全留。
二、承包期限
自_________年_________月_________日起至_________年_________月_________日止，共_________年。
三、上交利润定额
1．乙方在_________年内，上交利润总额为_________元。其中，_________年_________元，_________年_________元，_________年_________元。
2．超出定额部分的利润，全部留给乙方。
3．乙方应根据留利数额，建立生产发展基金，奖励基金和福利基金。三项基金的比例为：_________。
四、经济技术指标：_________。
五、技术改造任务：_________。
六、承包前债权债务的处理办法：_________。
七、贷款归还办法：_________。
八、承包期间，甲方有权根据法律和合同的规定监督检查乙方的生产经营情况；有权_________；
承包期间，甲方不得在法律和合同的规定之外随意干涉乙方的生产经营活动并有义务_________。
九、承包期间，乙方享有国家法律、法规、政策规定的经营管理自主权。
企业经营者_________为乙方法定代表人，对企业经营管理中的下列事项，有依法自主决定的权利：_________。
十、违约责任：_________。
十一、对企业经营者的奖惩：_________。
十二、争议的解决办法：_________。
十三、其他有关事项：_________。
十四、本合同自_________时起生效。合同正本_________，副本_________。
甲方（公章）：_________乙方（公章）：_________
法人代表（签章）：_________企业经营者（签章）：_________
摘 要 《保险法》作为规制保险经营活动，规范保险人，保护被保险人和受益人的一项基本法律制度在现代国家经济生活中起到了不可估量的作用。新《保险法》总结了以往司法实践的有益成果并借鉴了国外先进立法模式，对规范与保障保险关系各主体有了更加具体的规定，而作为保险关系各方主体权利义务的集中体现――保险合同，表现的尤为突出。本文试图通过分析保险合同订立的不同阶段中产生的问题，旨在为进一步完善新《保险法》相关规则提供理论借鉴。
关键词 新《保险法》 保险合同 条款
保险合同的成立与一般合同成立的构成要件相同。保险合同双方即投保人和保险人双方意思表示真实一致，保险合同即告成立。在保险合同订立过程中，一方当事人做出邀约，通常为投保人，内容具体确定，保险人在做保险宣传时若宣传内容具体确定的话也可认定为邀约，另一方当事人做出意思真实，内容形式有效的承诺，保险合同以有效承诺做出时即告成立，基本过程与普通合同并无二致。但是，对于保险合同订立的形式我们需要稍加讨论。根据我国传统《保险法》学说，保险合同是一种诺成性非要式合同，即可以以口头形式订立保险合同。对此笔者提出，应严格排除口头形式保险合同，其原因有二：一方面，保险合同通常时间持续较长，权利义务较为复杂，口头形式不足以将上述权利义务准确的表述及记录下来；另一方面，保险合同自成立到生效，直到保险人保险责任的确定中间间隔时间较长，要式保险合同可以有效排除双方对于合同的矛盾分歧。虽然我国《保险法》和《合同法》对此并未加以规定，依然秉承意思自由的原则，但诚如上文所言，行政法规和保监会制定的规章应严格排除口头形式保险合同。
保险人保险责任的起算是整个投保过程中的重中之重，因为其关系到投保人何时转移了自身风险，保险人何时具有危险承担义务，更重要的是关系到投保人能否获得赔偿。根据新《保险法》第十三条，十四条的规定可推知：对于大多数保险合同而言，保险合同生效，保险人保险责任随之开始，保险合同的生效时即为保险人承担保险责任的时间。但是，合同另有约定除外，也就是说，合同生效与保险人保险责任承担的时间未必同步，而实践中，这种情况占多数。保险人保险责任的承担往往都是附条件的，如投保人交付首期保险费，保险人承保并签发保险单等。保险责任的确定具有重要的意义，但是以现有的法律条文，不足以充分保障投保人的权利，若保险合同上规定以“保险公司同意承保时为承保责任开始时”而保险公司又迟迟不承保，在这段时间投保人的权益将如何保障。因此，笔者认为对于保险责任起算时间应更加明确，方案有三：一是将此类不明确或故意模糊保险责任起算时间的条款划为无效条款，这在下面会论述到；二是对该条文进行有利于投保人的解释；三是尽快出台《保险法实施细则》确定一个必要时间，如规定保险人在保险合同成立后的十到十五个工作日内做出承保与否等条文，对保险人的承保时间加以确定性限制。
新《保险法》中的保险人说明义务既是本法的核心重点，也是一个难点。本文对于该义务本身不做过多分析，只对说明义务的对象进行简要分析。新《保险法》对于说明义务有了三处变动，一是仅对于格式条文进行说明；二是在订约时需交付格式条文；三是对于责任免除条款的提示义务的确定。此次修改的重要意义不言而喻，但是对于其操作性笔者却持有保留态度。对于说明义务的核心无非有两点，说明对象与说明程度。根据新《保险法》规定，说明对象是格式条文，当下保险业使用的保险合同绝大多数都是格式合同，保险人是否要逐条为投保人进行解释？对于说明程度法律上沿用了“明确说明”这一模糊的概念，究竟怎么样才算明确？而对于保险人进行的说明，在事后投保人又如何举证？这一系列问题在新《保险法》中依然没有得到解决。反观免责条款的提示义务倒容易操作。
正如上文所言，保险合同条款绝大多数是格式条款。因此，必须在立法上予以限制，保护投保人的利益。《保险法》及《合同法》对此有专门规定。（一）保险合同中非格式条款的效力优于格式条款。《合同法》第四十一条规定“格式条款与非格式条款不一致的，应当采用非格式条款。”保险合同的格式条款一般是保险人一方的意思表示，而非格式条款往往是投保人与保险人双方合意的结果，是在格式条款外另行商定的条款，或对原格式条款重新协商修改的条款。因此，保险合同非格式条款的效力应当优于格式条款①。（二）如何正确理解《保险法》第三十条确立的“有利于投保人和受益人解释”原则。该规定被称为“有利解释”原则。但实践中，人们往往片面理解《保险法》第三十一条的规定，将这种“有利解释”原则扩大化加重保险人的责任。笔者认为，要正确适用《保险法》的这一原则，必须结合《合同法》的有关规定对其进行解释。《合同法》第四十一条规定“对格式条款的理解发生争议的，应当按照通常理解予以解释。”这里所说的“通常理解”，根据《合同法》第一百二十五条的规定进行解释。“通常理解”还包括这样一层意思，即应当按可能订立该合同的一般人的理解来解释合同条款，这里所讲的“一般人的理解”，是指不特定的群体对有关条款的理解，不能认为是具体某个人的理解。
注释：
①韩秀丽.在保险合同中的适用浅析.大众商务.2010.7.
参考文献：
[1]杨华柏.保险法律评论.法律出版社.2009.5.
[2]奚晓明.条文理解与适用.中国法制出版社.2010.
[3]韩秀丽.在保险合同中的适用浅析.大众商务.2010.7.
[4]张玉.免责条款在保险合同中的认定问题研究.兰州商学院学报.2009.8.
[5]吴定富.释义.中国财政经济出版社.2009.4.
小伙伴和健健玩，常常告状说健健爱打人。妈妈批评健健，健健却委屈地说是小伙伴先打他的。在幼儿园里，老师也反映健健很爱生气，别人稍碰他一下，他就不乐意，非要反击一下不可，小朋友经常告他的状。
诊断：
事实上，健健存在触觉过分敏感的问题，别人的轻轻一碰，他感受到的是“打”。这是由于健健早期触觉发育不完善造成的感觉统合失调，于是他对触觉刺激缺乏安全感，不喜欢有人的身体亲密接触，健健需要采取一定的措施，锻炼触觉适应能力。
不少妈妈觉得陌生：什么是感觉统合失调呢？感觉统合失调通俗的说法是“儿童大脑在发展过程中出现的障碍”，具体指外部的感觉刺激信号无法在孩子的大脑神经系统进行有效的组合，而使机体不能和谐的运作，久而久之形成各种障碍。
何谓感统失调？
感觉统合理论（Sensory Integration Theory） ，简称感统理论是由美国南加州大学临床心理专家爱尔丝博士（Ayresa.J）在1972 年提出的。感统失调的孩子智力水平正常，但其综合能力不足会抑制孩子的智力发展，使孩子原本很多优秀的地方表现不出来，长大后在学习或性格上出现这样那样的障碍。
感觉统合失调有先天生理原因和后天环境因素。在先天因素中，可能有胎位不正引起的平衡失调，也可能有因早产或剖腹产引起压迫感不足导致触觉失调。相对于先天因素，后天环境的影响因素更多。包括爬行不足造成前庭平衡失常；家长管束太多，造成孩子触觉刺激缺乏；家长事事包办，导致动作协调不良、本体感失调；长时间看动画片导致阅读视觉不良等等。
宝贝自测：
感觉统合失调有5大具体表现，来测一测，你家宝贝有没有感觉失调问题吧。
1.前庭平衡功能失常：孩子身体灵活度不足，双侧协调不佳，多动，注意力不集中，上课不专心，爱做小动作。语言发展迟缓、说话晚，语言表达困难，平衡感差，易晕车晕船等。
2.视觉感不良：孩子喜欢长时间地看动画片、玩电脑或电动玩具，却无法流利地阅读，朗读时经常多字少字。写字时偏旁部首常颠倒，甚至不愿认字，学了就忘，不会做计算，常抄错题等。
3.听觉感不良：经常对别人的话听而不见，或者听了就忘，经常忘记老师说的话和布置的作业。在学习中记忆力差，生活中容易丢三落四。
4.本体感失调：坐立不安、坐姿不良、走路跌跌撞撞、容易摔倒、不敢下楼梯，方向、距离感欠缺，手脚笨拙，精细动作困难等。
5.触觉过分敏感：紧张、孤僻、胆小内向、不合群、偏食、固执、脾气暴躁、害怕陌生环境、吮手指、咬指甲、爱哭、爱玩弄生殖器等。
孩子感统失调，妈妈分类训练
前庭平衡训练：可以采用一些玩具器械，帮助孩子调整前庭信息及平衡神经体系自动反应机能，促进语言神经组织和前庭平衡觉健全。如玩一玩滚圆筒、平衡脚踏车、按摩大龙球、滑滑梯、晃动独木桥、平衡台等游戏。
视觉感训练：首先要控制孩子看电视和玩电脑的时间，避免干扰视觉发展。家长可以和孩子玩一玩吹泡泡、放风筝、游戏棒等游戏，让孩子多一些训练，帮助加强眼部肌肉的控制，提供视觉和前庭觉的整合练习。
听觉感训练：孩子的听觉太弱，受不了太大的声音。如果家长经常大声责备孩子，会造成孩子形成自我保护，养成拒绝听别人说话的习惯。因此，家长首先要注意自己说话的语气音调。另外，经常和孩子开展听觉专注力的训练，如玩一玩听声音找动物、听声音找乐器的游戏。
本体感训练：本体感失调容易导致孩子关节紧张、对肢体控制能力不强、重心不稳。因此，要先加强孩子的关节活动，使孩子的关节肌肉放松，提高孩子对关节的支配能力。可以多开展一些大运动项目，如上下楼梯、平衡木、蹦床等，使孩子的肢体灵活起来。
考古发掘现场(以下简称发掘现场)动态监测系统由发掘现场动态环境监测系统和发掘现场无线实时监测平台两部分组成。
发掘现场无线实时监测平台发掘现场无线实时监测平台的作用是为发掘现场监测子系统提供实时的数据支持,由发掘现场硬件平台和发掘现场软件平台两个部分组成。发掘现场无线实时监测硬件平台由传感器节点、中继节点和网关三个部分组成:布置在现场的数据采集节点负责采集实时环境数据(如大气温湿度、光照强度、降尘和有害气体等),按照一定的路由规则将数据发送至通信范围内的父节点,然后通过中继节点的相互中继,将数据不断转发直至到达网关节点。网关节点通过远程通信方式,如卫星通信、Internet、GPRS等手段,将数据传送至远程客户终端。其中各个数据采集节点和中继节点根据RSSI(接收信号强度指示)和跳数来选择合适的中继节点作为父节点,并以此在数据采集节点和中继节点间建立簇内星状网络拓扑结构,中继节点之间则根据RSSI值建立树状网络拓扑结构。每个传感器节点和中继节点在上电后自动加入网络,并定期将采集到的数据沿最优路由方向传送至网关。发掘现场实时监测软件平台则由中间件、数据库和数据采集接口三个部分组成。数据采集接口将接收到的实时监测数据存入数据库中,中间件的作用则是将数据库中保存的监测数据取出,并提供给用户和子系统。
发掘现场环境监测系统由于监测系统需要对发掘现场的内外环境同时进行监测,因此发掘现场监测子系统由环境监测子系统和气象监测子系统组成。环境系统检测子系统主要是针对文物所处环境参数,如大气温度、大气相对湿度、土壤温度、土壤水分含量、文物表面温度、文物表面湿度、大气二氧化碳浓度、有机挥发物总量等参数进行监测。气象监测子系统主要是针对发掘现场所处小环境的气象参数,如光照度、紫外线强度、风速、风向、降雨量等参数的实时监测。监测系统的目的在于对文物所处环境的各种参数进行数据挖掘整理,精确掌握文物埋藏的环境参数,实现对出土文物在第一时间的检测分析以及文物出土环境参数的采集,建立环境参数历史数据库,为文物预防性保护提供技术支撑,并为文物保护措施的制订提供科学依据。
案例研究
凤栖原文物保存环境监测数据分析凤栖原张安世墓葬遗址属于西汉宣帝时期的重臣、被封富平侯的大司马将军张安世。张安世在西汉的地位举足轻重,其墓葬的出土文物进一步证实了这一点,出土的很多随葬品都属于西汉皇帝御赐物件。根据发掘现场实际状况及需要,目前已部署七个监测点,监测时段大约在八个月左右,监测点部署图如下(图4)。数据记录及分析3月份期间,凤栖原张安世墓葬遗址气象站监测数据存在较大波动(图5)。其中3月19日-3月21日期间,环境温度基本保持在4℃左右,环境湿度基本保持在100%,波动均不大,光照变化范围也缩减至0-2000lx之间。结合当时的天气变化,3月天气刚刚由寒转暖,气候变化较频繁,3月19日-3月21日是降雨天气,持续阴天,光照度较低,导致空气中水分蒸发较少。3月22日停止降水后,光照开始恢复,环境湿度逐渐下降,气温也逐渐回升(因水分挥发缓慢,恢复的较为迟缓)。总体来看,3月份气象站的大气温度变化为0℃到23℃之间,大气湿度在16%到75%之间,每天的照度变化最大范围0lx到8500lx内,气象站数据与环境数值较一致,温度、湿度、光照度也保持合理的变化趋势。环境变化正常,期间出现的特殊变化,多是天气变化引起的。查看这一段时间82号监测点的土壤温度和含水量的变化,遗址坑内的土壤温度和土壤水分含量变化波动较大(图6),其中3月19日-3月21日土壤水分含量逐渐升高(由4.34%上升至4.65%),土壤温度也随之逐渐降低(由10.5℃下降至5℃)。结合气象站的监测结果看,3月天气变化频繁,3月19日-3月21日为降雨天气,室内土壤虽然不直接受到降雨给监测数据带来的骤然变化,但由于受到外界土壤水分的渗透作用,土壤温度和水分含量也随之以相同的趋势逐渐变化。3月22日停止降水后,土壤水分含量逐渐下降,土壤温度也逐渐回升。总体来看,土壤温度在5.2℃到13℃范围之间、土壤含水在4.3%到4.65%范围之间保持着较为稳定的变化,并且二者保持相符的变化趋势。期间出现的特殊变化,多是天气变化引起的(可查看气象站数据变化)。查看这一段时间90号监测点的大气温湿度变化,3月期间遗址环境的大气温湿度波动较大(图7)。其中3月19日-3月21日,大气温度由10℃骤降至1℃,大气湿度由41%骤升至98%,变图4监测点部署图化显着。结合气象站的监测结果看,3月19日-3月21日为降雨天气,大气温湿度受到直接影响带来的突然变化。3月22日停止降水后,大气温度逐渐回升,大气湿度也逐渐回落,监测点数据准确反映了监测区域的环境变化。总体来看,大气环境温度在1℃到22℃范围内、大气环境湿度在20%-98%范围内保持着稳定的变化,并且二者保持相符的变化趋势。期间出现的特殊变化,多是天气变化引起的(可查看气象站数据变化)。查看这一段时间92号监测点的大气温湿度变化,3月期间遗址环境的大气温湿度波动较大(图8)。其中3月19日-3月21日,大气温度由10℃骤降至0℃,大气湿度由50%骤升至100%,变化显着。结合气象站的监测结果看,3月19日-3月21日为降雨天气,大气温湿度受到直接影响导致突然变化。3月22日停止降水后,大气温度逐渐回升,大气湿度也逐渐回落,监测点数据准确反映了监测区域的环境变化。总体来看,大气环境温度在0℃到22.5℃范围内、大气环境湿度在20%-100%范围内保持着稳定的变化,并且二者保持相符的变化趋势。期间出现的特殊变化,多是天气变化引起的(可查看气象站数据变化)。总结对比4个监测点的数据变化,监测点的传感量数据变化和环境变化保持一致,并且与当时的天气环境较一致,说明数据正确反映了监测区域的环境变化。
高陵张栋家族墓文物保存环境监测数据分析2011年陕西考古研究院专家在高陵县泾河工业园发现一处罕见的完整明代家族墓园。据墓志记载,墓主人张栋生前为秦藩王府知印。这一发现对研究明代墓葬制度、风俗文化具有重要作用。根据发掘现场实际状况及需要,目前已部署十一个监测点,监测点部署图如下(图9)。说明:100号监测点:自动气象站--监测外界环境。52、53、54、55号监测点:大气温湿度传感器--其中53号监测点监测墓室底部到地表中间部位的环境,其他监测点监测墓室中的环境。61、62、63、64、65号监测点:土壤温度、土壤水分含量传感器--其中65号监测点监测墓室底部到地表中间部位的环境,其他监测点监测墓室中的环境。71号监测点:二氧化碳传感器--监测墓室中二氧化碳含量。数据记录及图形分析查看这一段时间52号监测点的大气温湿度变化,5月期间遗址环境的大气温湿度波动较大(图10)。其中5月1日-5月3日期间,湿度维持在82%-93%之间,温度在17.5℃-22.5℃之间,基本保持在高湿、低温的水平,昼夜温差和湿度差较小;5月11日-5月12日温度湿度和光照度骤变,湿度由62%升至88%,温度由25℃降至最低17℃。
结合气象站的监测结果看,5月为春季末尾,气温总体呈缓慢上升趋势,并偶尔伴随降雨。5月1日-5月3日、5月11日-5月12日是降雨天气,湿度很大,气温较低。无降水期间,光照逐渐充裕,环境湿度逐渐下降,气温也逐渐回升并呈上升趋势。总体来看,当月大气环境温度在16℃到35℃范围内、大气环境湿度在20%到98%范围内保持着稳定的变化,并且二者保持相符的
变化趋势。监测点数据准确反映了监测区域的环境变化。期间出现的特殊变化,多是天气变化引起的(可查看气象站数据进行对比)。查看这一段时间71号监测点的二氧化碳含量变化,5月期间遗址环境的二氧化碳含量波动较大(图11)。以5月9日为分界,5月1-9日二氧化碳含量在200-450ppm之间波动较大且均值偏高,5月9-20日二氧化碳含量在200-330ppm之间波动较小且均值偏低。经调查,5月1-9日,71号监测点放置于M4考古发掘现场,现场白天有大量工作人员活动,白天由人体排放的二氧化碳使得空气中二氧化碳浓度较高,夜晚则恢复至正常水平;5月9日之后,为防止因挖掘工作破坏监测设备,工作人员将其挪至无人活动的M5内,并以不透气薄膜覆盖,给71号监测设备营造出密闭的微环境,故而二氧化碳含量偏低且波动较小。其中5月1日-5月3日期间,二氧化碳含量在300-430ppm之间变化幅度相对较小,基本保持在高湿、低温、高浓度二氧化碳的水平。经分析,因期间有降雨,空气流通不畅,故而空气中二氧化碳含量一直保持在较高水平且波动较小。结合气象站的监测结果看,监测点数据准确反映了监测区域的环境变化,并且三者保持相符的变化趋势。期间出现的特殊变化,多是天气变化引起的(可查看气象站数据变化进行对比)。查看这一段时间53号监测点的大气温湿度变化,5月期间遗址环境的大气温湿度波动较大(图12)。其中5月1日-5月3日期间,湿度维持在60%-100%之间,温度在16-28℃之间,基本保持在高湿、低温的水平,昼夜温差和湿度差相对较小;5月11日-5月12日温度湿度和光照度骤变,湿度由62%升至100%,温度由25℃降至最低17℃,之后的3天内,湿度的最高值均能达到100%。结合气象站的监测结果看,5月为春季末尾,气温总体呈缓慢上升趋势,并伴随偶尔降雨。5月1日-5月3日、5月11日-5月12日是降雨天气,湿度很大,气温较低。无降水期间,气温呈缓慢上升趋势。 结合监测点的布设位置(53号节点布设在墓底部和地表中间位置),且通风不畅导致湿度在降雨之后的3天内并没有立即回落,而是逐渐降低且较其他监测点数据高。总体来看,监测点数据准确反映了监测区域的环境变化,环境变化正常。期间出现的特殊变化,多是天气变化引起的(可查看气象站数据变化)。查看这一段时间65号监测点的土壤温度和含水量的变化,坑内的土壤温度和土壤水分含量变化波动较大(图13),5月1-11日土壤水分含量保持在20-43%之间,土壤温度变化范围维持在18-21℃之间;5月12日土壤水分含量由15%突升至42%,土壤温度峰值也由29℃大幅降至23.5℃,之后逐渐恢复至平均水平。经调查,5月1-11日监测设备放置于墓室内,故而受外界降雨等影响较小且缓慢,5月12日之后设备被挪至墓室外环境,由于当日有降雨,室外湿度较大,所以监测数据突增。总体来看,土壤温度在19.5℃到29.5℃之间、土壤含水率在15%到43%之间保持着较为稳定的变化,并且二者保持相符的变化趋势。期间出现的特殊变化,多是天气变化引起的(可查看气象站数据变化)。5月份期间,高陵张栋家族墓遗址内气象站监测数据存在较大波动(图14)。其中5月1日-5月3日期间,湿度维持在82-100%之间,温度在15-23℃之间,照度在0-5000lx之间,基本保持在高湿、低温、弱光照的水平,昼夜温差和湿度差较小;5月11日-5月12日温度湿度和光照度骤变,湿度由60%升至100%,温度由22℃降至最低12℃,光照度变化范围也缩减至0-4200lx。结合当时的天气变化,5月为春季末尾,气温总体呈缓慢上升趋势,并偶尔伴随降雨。5月1日-5月3日、5月11日-5月12日是降雨天气,持续阴天,光照度较低,气温降低。无降水期间,光照逐渐充裕,环境湿度逐渐下降,气温也逐渐回升并呈上升趋势。总体来看,气象站的大气温度在12-32.5℃之间,大气湿度在18%-100%之间,照度变化最大范围为0-9000lx,气象站数据与环境数值较一致,温度、湿度、光照度也保持合理的变化趋势。环境变化正常,期间出现的特殊变化,多是天气变化引起的。总结对比4个监测点的数据变化,监测点的传感量数据变化和环境变化保持一致,并且与当时的气候环境较一致,说明数据正确反映了监测区域的环境变化。
最近一些年以来，农民工家庭成为儿童家暴的“重灾区”。由于儿童缺乏自我保护的能力，造成了儿童家暴事件难以被外人察觉，也使得社会工作比较难以介入干预。由此，这成为社会不稳定的家庭隐患。按照正常的心理和行为模式来说，家长对儿童应爱惜和保护，怎么会发生违反常理和法律的恶意伤害行为哪？
（一）这与农民工家庭生活的城市环境有直接关系。在城市打工的农民工，生存状况比较差，农民工的日常工作十分繁重，不但收入比较低，而且社会地位也很低，得不到当地人的尊重和包容，使得这些农民工承受着生活的压力与艰辛，其子女遭受了身份歧视等等。
（二）一些农民工的子女较长时间生活在农村，与其父母在一起生活时间较少，父母与子女进行交流沟通机会也很少，使得他们之间的感情比较脆弱。这些农民工子女来到城市与其父母一起生活，家庭成员之间难免有着隔阂和鸿沟，子女对城市生活的陌生，加上农民工的教育程度比较低，使得他们之间沟通起来比较困难，往往采取简单粗暴的方式来教育子女，一旦这些儿童没有听话或做错事情，常常遭受父母的毒打。这些农民工一方面觉得是在正当地教育子女，另一方面也是潜意识的将生活压力与不满释放在孩子身上。因此，农民工子女作为弱势群体理应受到社会的关爱。
二、农民工对儿童家庭暴力事件的特点分析
（一）家庭暴力主要被侵害的对象是妇女与儿童。本文重点分析的是农民工对儿童的家庭暴力事件的特点。儿童的家庭暴力发生在家庭成员之间，父母以殴打和残害为主要方式，对儿童的身心进行的伤害性行为。在社会经济发生转型的阶段，农民工的生活压力加大，生活节奏加快，多种因素促使对儿童的家暴事件的频繁发生，导致家庭悲剧的不断出现。对儿童家庭暴力的类型主要包括身体暴力和精神暴力。前者是指对儿童身体进行攻击，例如殴打。后者是指通过威胁恐吓的方式对儿童进行精神的摧残与心理的伤害。
（二）农民工对儿童家庭暴力事件的特点主要有两个，家庭暴力的隐蔽性、长期性与严重破坏性。家庭暴力事件发生在家庭内部，难以被外人所察觉知晓，儿童受害者缺乏倾诉对象与保护者，家长常常将家暴作为调整家庭内部关系的手段，而觉得存在的合理。而外部人员也不方便介入和干预，这样导致儿童受到家庭暴力具有长期性。儿童会经常性地遭受家庭暴力，直到被侵害的儿童出现严重的病症或死亡，才被外界所知晓。儿童对家庭暴力反抗的脆弱性，使得儿童的身心备受折磨，有的甚至难以承受严重的身体伤害出现了休克与死亡。农民工对儿童的家庭暴力事件严重威胁着家庭的安定，给社会造成严重的伤害。
三、建立健全家暴的社会工作干预的必要性
家庭社会工作干预目的是保证家庭的正常运转秩序，以社会资源来维护家庭的功能与良性发展，协调好家庭成员的关系，更好满足各家庭成员的需要
（一）家庭社会工作干预具有特殊的维护功能。社会工作的介入能够针对家庭的困境进行帮助，消弭家庭矛盾，维护家庭的正常功能。因此，社会工作干预家庭暴力方面具有特殊的作用。同时，社会工作干预遵守职业道德规范，能够宽容、保密，对家暴实施者进行心理疏导，排解其心理困扰。
（二）家庭社会工作干预能够组织团结反对家暴的社会资源与力量，扩大社会干预力量，更好地帮助这些家暴受害的儿童。因此，家庭社会干预有利于建立社区干预服务系统，挖掘社会非正式、潜在的资源，形成多元化服务系统；由此演化出居民的自助和互动的有偿服务、交换服务。
（三）家庭社会工作干预能够平衡家庭组织结构。由于家庭组织结构力量的不均衡，就容易出现施暴者欺压和控制受害的弱者。通过家庭社会工作干预的介入，能够稳定家庭的组织结构体系，达到一种平衡状况，改善家庭成员的沟通模式和秩序，促进家庭的长期和谐稳定。
四、家暴的社会工作干预模式选择路径与对策
（一）家暴的社会工作干预模式选择路径
社会工作干预为家暴受害者提供服务，通过三种路径实施社会工作干预模式，包括：
（1）个案工作介入。由于农民工社会生活压力比较大，家庭相对不够稳定，使得家庭的自行调节功能降低，家庭经常性地陷入困境，导致对儿童的暴力事件。将出现暴力事件的家庭或者受害儿童作为案主，采用直接的、面对面的沟通与交流，采取专业技术来帮助受害儿童，确保其个人权利，健全家庭的功能。给予家庭成员心理疏导与治疗，消除家庭矛盾，减少家庭暴力事件的发生。
（2）小组工作介入。以小组情境与小组互动及小组成员的相互支持，改善施暴者和受暴者的态度与行为。通过娱乐、教育及治疗等多种互动方法的运用，使小组成员实现彼此交流，达到治疗和预防儿童家庭暴力的目标。
（3）社区工作介入。以社区为基础，调动和利用社区资源对儿童家庭暴力进行干预。将反家庭暴力纳入社区日常工作，充分发挥组织的调解作用，联结公安、司法、医院、妇联及其他部门，建立起多层次多机构的社会支持体系，干预家庭暴力事件发生机引发的伤害。
（二）家暴的社会工作干预模式对策
增强社区对家庭的支持作用。社区应建立家庭服务中心，提供相关的咨询、辅导救助服务。发挥学校在家庭暴力防治中的举足轻重作用，预防家庭暴力，及时发现症兆。公安机关干预和制止家庭暴力，推进社区警务工作反家庭暴力。建立家庭暴力事件数据库，为规划家庭暴力防治提供参考。法制宣传教育增进农民工对家庭暴力的法律认知。为受害儿童设置避难所，提供有效的救助措施。
抵押住房保障的对象是购房者的利益。保险公司按信用保证保险条款在购房者连续三个月无法按贷款合同规定还本付息而代为还贷， 一段时期之后， 保险公司要向借款人追偿代付的欠款和利息， 如购房人无力偿还债务， 则保险公司有权处置抵押房产， 这时购房人将在遭受天灾人祸之后， 面临着房产被抵押拍卖及流离失所的悲惨境地， 而这时能够避免这种悲剧发生的险种就是住房抵押贷款寿险， 该项保险保障购房者因疾病或意外事故导致身故或伤残时， 其家庭其他成员可使用保险公司所提供的保证金继续按月归还贷款， 直至本息归还完毕。
抵押住房保险涉及购房借款人、保险公司、贷款银行和房产开发商等不同利益主体，有助于抵押住房保险的顺利实施，有助于当事各方在实践中依法维护自身的合法权益。
一、抵押住房保险涉及到贷款银行、借款人、保险公司三方， 他们之间有如下法律关系
1、贷款银行与借款人之间是借款关系， 法律关系的基础是借贷合同。
借款人向贷款银行申请个人住房贷款的， 贷款银行审核同意后会与借款人签订个人住房贷款合同， 由于个人信用制度不健全， 银行为了保证债权的实现， 还会要求签订房屋抵押合同， 而为了进一步确保抵押物的安全， 又要求借款人将抵押房屋投保财产保险。
2、借款人与保险公司之间是保险关系， 法律关系的基础是保险合同。
如前所述， 借款人根据贷款银行的要求， 向保险公司投保抵押住房保险， 两者形成一个保险合同的关系。从客观情况来看， 抵押住房保险合同与抵押贷款合同中对抵押房屋保险的要求息息相关， 但从法律的角度来看， 两者是相对独立的， 并非主合同与从合同的关系。
3、贷款银行与保险公司之间是关系， 法律关系的基础是保险兼业协议。
为简化手续， 保险公司通常委托银行抵押房屋保险业务，并支付一定比例的佣金， 由此双方便产生了兼业关系。此外， 银行作为保险合同的受益人， 又成了保险合同中的关系人， 享有一定的权利和义务。根据借款人与保险公司之间的约定， 贷款银行作为保险合同的第一受益人， 可以在发生保险事故时向保险公司提出就保险赔款优先受偿的要求。除此以外， 贷款银行与保险公司之间并无直接的法律关系。
二、投保抵押住房保险是否为购房借款人的必须合同义务
想必对于贷款银行要求购房借款人为抵押住房办理保险，有些人对此不理解，认为这违反了《保险法》关于不得强制保险的规定，对银行和保险公司提出异议。对此，有些银行或保险公司简单地解释为，是执行中国人民银行《个人住房贷款管理办法》的规定。
的确，中国人民银行在《个人住房贷款管理办法》1中规定了购房借款人抵押住房时应办理保险，但中国人民银行这一管理办法在法律性质上属于部门行政规章，不属于人大制定的法律或国务院制定的行政法规，不能满足保险法规定的只有法律或行政法规才能规定强制保险的条件，因此这一解释在法律上是不具有说服力的。
然而实际上，购房借款人办理保险不是银行单方强制行为，而是购房借款人与贷款银行自愿订立的贷款合同约定的借款人义务。
购房人在积蓄不足的情况下，希望提前购房消费，为实现这一目的，购房人选择向银行申请贷款。在购房人与银行协商订立贷款合同时，银行为了保证自身债权的实现，即确保发放的贷款能安全收回，依据担保法要求购房借款人提供担保作为发放贷款的条件之一。担保可以采取保证、质押或抵押等不同方式。例如，由房屋置业担保公司为购房借款人提供保证；或由购房借款人将定期存单、债券等有价证券质押给银行；或由购房借款人将购得的住房抵押给银行等。具体采用何种担保方式可由借款人根据自身情况与贷款银行协商确定。在双方选择了以抵押方式提供担保后，银行作为抵押权人根据担保法可以要求抵押人即购房借款人采取适当措施保全用于抵押的住房的价值，抵押住房保险便是一种有效可行的保全住房价值的方式。因此，双方在贷款合同中就约定了由购房借款人投保抵押住房保险。投保抵押住房保险与返还本金、支付利息、提供抵押一样，都是借款人的合同义务。借款人在享受从银行获得贷款权利的同时承担相应义务是等价有偿的公平交易行为，完全符合民事法律要求的公平自愿原则。抵押住房保险是使购房借款人、银行、保险公司和房产商都能从中获利的多赢机制，理应得到包括购房借款人在内的各方欢迎和支持。
需要提醒的是，银行可以要求购房借款人投保抵押住房保险，但不能规定购房借款人必须向其指定的保险公司投保，银行指定保险公司投保剥夺了借款人的选择权，限制了保险公司之间的公平竞争，违反法律关于反不正当竞争的规定，购房借款人有权拒绝。由于此类行为曾受到处罚， 目前由于这种原因引起的纠纷已不多见。
三、如果抵押住房在交付购房人之前发生保险事故的，保险公司是否应当赔偿
保险公司何时开始承担保险责任，由保险条款规定或保险公司与投保人即购房贷款人双方约定。
但有专业人士对保险生效日的规定存有异议，指出对于还贷保证保险，保险期限自贷款合同生效时开始是可以的，但对于财产损失保险，作同样的规定就不合适了。因为从贷款合同生效银行向房产商划付贷款到房产商向购房人交付房屋或登记产权之间有一段间隔期间，如果是购买期房，这段期间会间隔得更长。在这期间由于未办理产权登记，购房人对房屋不具有所有权，房产商未向购房人交付房屋前，购房人依合同法也无须承担房屋毁损灭失的风险，因而购房人对房屋不具有法律上承认的利益，不符合保险法规定的投保人应对保险标的具有保险利益的要求，使得保险合同中的财产损失保险在此期间无效，即抵押住房在交付购房人之前发生保险事故的，保险公司不负责赔偿。
这种观点有一定的道理，但忽视了一个重要事实，即购房人在办理贷款手续和保险手续之前，已与房产商订立了房屋买卖合同，购房人在自付了首付款和通过银行支付了约定房款后，依购房合同其对房产商就享有了债权，债权的内容为房产商须按合同约定向购房人交付约定的房屋。如果抵押房屋在交付购房人之前发生毁损灭失，将直接造成对购房人债权的损害，所以在抵押住房交付购房人之前购房人对该房屋具有保险利益，购房人是否占有该房屋并不影响保险合同的效力。即使房产商还未交房，如抵押房屋发生保险事故造成损失时，购房借款人也可以请求保险公司赔偿损失。
因此，抵押住房在交付购房人之前发生保险事故的，保险公司应当赔偿。
总之，稳定完善的抵押住房贷款保险体系在房地产保险的发展中具有不容忽视的作用。以美国为例，其实行的是非营利性的政府机构和私营商业保险公司共同构成的住房抵押贷款保险体系。这种政策性和商业性保险相结合，共同分担风险的模式，使其有效地应对住房抵押贷款中可能存在的风险。
目前，住房抵押贷款保险体系在我国有一定的基石，如保险法和房地产法中相关的规定，但因为其突出的重要地位而所需求的专门的调制规范还没有建立，因此一直没有得到完善。我国政府应在完善政策法规加强监督力度和设置政策性保险机构等方面深入参与到房地产保险市场中。可以基于现行部门规章及各地政府管理办法中存在的缺陷，建立与完善房地产保险相关政策法规；可以为保障房地产保险市场的有序发展，保险监管部门应加大监管力度；可以探索设立政策性房地产保险机构，房地产保险机构的设置是否恰当合理，关系到我国房地产市场的持续正常发展。
【关键词】 骨髓间充质干细胞；软骨细胞；共同培养技术；脱钙骨基质；关节软骨修复
Fullthickness articular cartilage defect repairment by coculture of autogenic bone marrowderived mesenchymal stem cells with chondrocytes and implantation into allogenic demineralized bone matrix in rabbits
【Abstract】 AIM: To investigate the feasibility of articular cartilage defect repairment by coculture of autogenic bone marrowderived mesenchymal stem cells(BMSCs) with chondrocytetes and implantation into allogenic demineralized bone matrix(DBM)， evaluate the outcomes of repairment in order to provide a theoretical basis for optimizing cell resources for seeding. METHODS: Twopassaged BMSCs and chondrocytes were collected both at a concentration of 5×109/L and then cocultured at 2∶1. Articular cartilage defects in the knee joints of rabbits repaired by the cocultured cells seeded into allogenic DBM served as experimental group A， by simple DBM as control group B and by nothing as control group C. Repaired tissues were evaluated with macroscopic observation，histological scores and immunohistochemical staining at week 8 and 16 after transplantation. RESULTS: Chondrocytes cocultured became rich in extracellular matrix and proliferated promptly. The ratio of chondrocytes to BMSCs achieved above 1∶1 at 5-7 d after coculture.In the experimental group A repaired tissues represented hyaline，smooth and flat. Chondrocytes in the zones of integrating with peripheral native cartilages were more mature. In the control group B and C， repaired tissues were fibers.Histological scores indicated that experimental group A excelled group B and C， and the differences were statistically significant(P0.05). Immunohistochemical staining showed that cells in the zones of repaired tissues were larger in size， arranged columnnedly， rich in typeⅡcollagen matrix and integrated satisfactorily with native adjacent cartilages and subchondral bones in the experimental group A at week 16 postoperatively. CONCLUSION: Coculture of autogenic BMSCs with chondrocytes can promote the proliferation of chondrocytes and the production of chondral matrix. Cocultured cells for seeding can save a number of chondrocytes， shorten culture periods and reduce subculture times. Cocultured cells embedded into DBM can repair articular cartilage defects effectively.
【Keywords】 bone marrowderived mesenchymal stem cells; chondrocytes; coculture techniques; demineralized bone matrix; articular cartilage repair
【摘要】 目的： 探讨自体骨髓间充质干细胞(BMSCs)与软骨细胞共培养复合同种异体脱钙骨基质（DBM）修复关节软骨缺损的可行性，评价修复效果，为优化种子细胞源提供依据. 方法： 取浓度为5×109/L的第二代BMSCs和软骨细胞，按2∶1比例混匀共培养作为种子细胞. DBM与共培养细胞复合植入修复为实验组（A组），单纯材料DBM组（B组）和不处理组（C组）作为实验对照组. 移植8和16 wk后经大体观察、组织学评分和免疫组化染色评价缺损修复. 结果： 共培养的软骨细胞基质合成丰富，细胞增殖快，共培养5～7 d两种细胞比例达1∶1以上. A组缺损修复组织呈软骨样，表面光滑平坦，与周围软骨整合的软骨细胞更为成熟. B组和C组的修复组织呈纤维组织. 组织学评分表明A组优于B， C两组，差异具有统计学意义（P0.05）. 免疫组化染色显示A组修复组织的细胞为透明软骨样细胞，柱状排列，Ⅱ型胶原染色阳性，与周围软骨及软骨下骨整合良好. 结论： 自体BMSCs与软骨细胞共培养，BMSCs能增强软骨细胞的增殖，促进软骨细胞基质合成，缩短软骨细胞培养时间和减少传代次数，可节省大量的软骨细胞，与DBM复合后能有效修复关节软骨缺损.
【关键词】 骨髓间充质干细胞；软骨细胞；共同培养技术；脱钙骨基质；关节软骨修复
0引言
关节软骨缺损自身不能有效修复，组织工程技术为解决这一难题提供了新的思路. 但由于软骨细胞来源不足严重制约了其应用［1］. 以自体软骨细胞作为种子细胞，取材部位受限，软骨细胞培养增殖能力低，传代培养容易引起老化和去分化［2］，而成体骨髓中骨髓间充质干细胞（bone marrow mesenchymal stem cells， BMSCs）含量少，随传代次数的增多，成软骨潜能明显降低， Rubio等［3］研究证实BMSCs多次传代培养有致瘤倾向. 我们应用自体BMSCs和软骨细胞共培养复合同种异体脱钙骨基质（demineralized bone matrix， DBM）修复兔膝关节软骨全层缺损，并对修复组织进行评价，为优化种子细胞源提供实验依据.
1材料和方法
1.1材料DMEM培养基（美国Gibco公司）；胎牛血清（FBS）（杭州四季青生物公司）；CO2孵育箱（恒温培养箱，日本Sony公司）；胶原酶（美国Sigma公司）；相差显微镜（日本BH2型Olympus显微镜）；Ⅱ型胶原免疫试剂盒（武汉博士德生物公司）；青紫兰兔（卫生部兰州生物制品研究所提供）.
1.2方法
1.2.1BMSCs与软骨细胞共培养取本研究所实验室培养的第二代自体BMSCs，浓度为5×109/L的悬浮液1 mL和相同浓度的软骨细胞悬液0.5 mL （2∶1）混匀，用含150 mL/L FBS的DMEM培养基在37℃饱和湿度条件下的CO2孵育箱中进行共培养，待细胞汇合至单层用2.5 g/L胰酶消化与同种异体DBM复合.
1.2.2同种异体DBM的制备处死同种青紫蓝兔，取四肢骨干骺端及椎体松质骨，剔除附着的肌肉及骨膜，-80℃冰柜中冻存72 h，参照文献［4］的方法进行脱钙后，再将骨块置于乙醚和乙醇中脱脂各24 h，用无菌蒸馏水反复冲洗浸泡至中性，自然干燥后环氧乙烷消毒，4℃保存备用.
1.2.3动物模型与实验分组3～6个月龄的青紫兰兔54只，体质量1.0～1.5 kg，雌雄不限. 取膝关节内侧弧形切口，向外翻开髌骨暴露膝关节，于股骨滑车关节面上用φ4 mm钻头钻孔，深度约3～4 mm穿透软骨下骨，有阻力感见新鲜血液溢出，造成全层关节软骨缺损模型. 将动物随机分为A， B， C三个处理组，每组18只. A组于软骨缺损处植入共培养细胞DBM（细胞均为自体细胞）；B组单纯植入DBM；C组不作任何植入.
1.2.4指标观察相差显微镜下观察共培养细胞的形态和增殖，并对共培养细胞爬片进行番红0染色. 每组移植术后8和16 wk分别处死9只动物，取出膝关节对修复组织分别进行大体、组织学和免疫组织化学观测. 参照文献［5］的评分标准，对术后8和16 wk各组动物分别进行组织学评分
统计学处理： 应用SPSS10.0软件包对所有数据进行统计学处理，各组间差异采用单因素方差分析，P＜0.05认为差异有统计学意义.
2结果
2.1共培养细胞形态学观察共培养细胞24 h后逐渐贴壁，软骨细胞呈椭圆形或三角形，大部分居混合细胞的中央，表面光滑，细胞体积变大，胞质增多，细胞数量多增殖旺盛，细胞外基质合成丰富被番红0均匀染色;BMSCs细胞体积无明显增大，散在于共培养细胞中，表面呈成纤维细胞样染色阴性，所占比例逐渐降低. 共培养5～7 d，软骨细胞与BMSCs比例达1∶1以上（图1）.
图1BMSCs和软骨细胞共培养番红0染色×200(蓝色箭头示软骨细胞，红色箭头示BMSCs)（略）
2.2大体标本观察术后所有动物切口愈合良好，关节液清亮，关节腔无粘连、滑膜增生、关节游离体及骨赘形成. A组： 术后8 wk缺损已由半透明、淡红色组织填充，边界模糊，表面光滑；16 wk与周围软骨色泽相近，表面平整（图2）. B组： 术后8 wk缺损区修复组织为乳白色，表面不光整，部分仍呈空洞；16 wk为纤维性修复. C组：术后8 wk缺损区为纤维样组织覆盖，色泽暗灰；16 wk周围软骨呈虫蚀样改变.
2.3组织学观察A组： 术后8 wk修复组织细胞较多，以圆形透明软骨样细胞为主，有软骨陷窝，表层有梭形成纤维样细胞，与周围软骨结合，基底部较多新生骨形成；16 wk修复组织为透明软骨样，厚度接近正常，与周围软骨结合好，深层软骨钙化，与底层骨结合紧密，基质着色正常，未见DBM残留（图3）. B组： 术后8 wk缺损组织细胞较少，细胞层次排列差；16 wk修复组织菲薄，呈纤维样，与周围软骨未结合，基底部有少量新生骨形成. C组： 术后8 wk缺损组织有薄层纤维组织覆盖；16 wk缺损区纤维组织进一步增厚，与周围软骨未结合. 术后8和16 wk A组评分均优于B， C组（P0.05）.
图2共培养细胞DBM修复关节缺损的大体观察(箭头示修复部位)（略）
图3共培养细胞DBM组修复关节缺损的组织学观察甲苯胺兰染色×200(箭头示修复组织)（略）
2.4免疫组织化学术后16 wk时A组修复组织中细胞呈圆形或椭圆形，形体大柱状排列，与周围软骨及软骨下骨整合良好，细胞质和细胞外间质中Ⅱ型胶原染色阳性，出现棕黄色颗粒（图4）；B组和C组修复组织未出现黄染的阳性区域.
图4免疫组织化学染色检测共培养细胞DBM组修复组织的Ⅱ型胶原DAB染色×100(箭头示修复组织)（略）
3讨论
关节软骨组织代谢活性较低，创伤和手术等所致的软骨损伤或缺损难以自我修复或以纤维组织填充替代，影响关节功能的恢复. 细胞生物学和生物材料技术的发展，应用组织工程技术修复软骨缺损成为可能，但是至今尚无一种细胞能完全满足软骨组织工程对种子细胞的要求［6］. Tsuchiya等［7］用人BMSCs与牛软骨细胞按不同比例混合进行共培养，发现软骨细胞的增殖速度和细胞外基质的合成与BMSCs的比例呈正相关. 我们通过BMSCs与软骨细胞体外共培养发现，共培养的软骨细胞比单独培养的同代软骨细胞体积大，增殖速度加快，有大量成熟的软骨陷窝形成和基质合成，说明BMSCs能促进软骨细胞的增殖和表型维持，因此，共培养使软骨细胞快速增殖，这就节省了软骨细胞的用量，避免了为获取足够量的软骨细胞反复传代培养而引起的软骨细胞老化和去分化［2］. 而BMSCs体积变化不明显或轻度缩小，并且连续培养后两种细胞的比例仍可保持在2∶1左右，说明软骨细胞和BMSCs的增殖速度相接近，这与Tsuchiya等［7］的结果相似，这是否由软骨细胞将BMSCs诱导成或将分化为软骨细胞并合成细胞外基质，尚需进行深入研究.
单独BMSCs在非软骨环境下并不能构建出软骨组织，而用20%以上的少量软骨细胞与BMSCs共培养可构建出成熟的工程化软骨，并且在软骨湿重、糖胺多糖含量和软骨特异性基质表达等方面都优于相同数量的软骨细胞构建的软骨，比用单独软骨细胞构建软骨组织可减少60%～80%的软骨细胞量，为解决软骨细胞来源不足提供了切实可行的途径［8］. 研究表明BMSCs和软骨细胞共培养期间TGFβ3， BMP2， IGF1和FGF2等生长因子表达增加5.4～11.6倍不等，增强的活性因子介导软骨细胞旁分泌或自分泌，可能是促进软骨细胞增殖和表型维持的主要因素之一，Goldberg等［9］应用含血清和TGFβ的培养基分别培养软骨细胞进行比较，结果也显示TGFβ能使去分化的软骨细胞重新分化和表型的维持，但具体的信号传导及其途径尚不清楚［10-12］.
我们应用BMSCs和软骨细胞共培养与DBM复合移植修复关节软骨缺损，修复组织内细胞形态类似于透明软骨细胞，细胞周围有软骨陷窝形成，免疫组化结果显示为Ⅱ型胶原纤维，证实了修复组织为透明样软骨. 共培养复合物中的BMSCs直接分化为骨细胞直接与周围的软骨下骨进行骨与骨的整合，比单独培养的软骨细胞与软骨下骨结合更加牢固，但修复组织与周围正常软骨仍有差别，主要表现为细胞数量多且排列紊乱，术后16 wk细胞数量减少并出现了柱状排列趋势，更接近于正常软骨组织，可能是术后不限制关节活动，修复组织在局部应力作用下发生改建所致［13］. B组软骨缺损基底部也有新骨形成，是由于载体材料的存在使髓腔或松质骨中的MSCs驻留在损伤区底部，进而分化成少量骨组织［14］.
我们应用的同种异体DBM是经冷冻、脱脂、脱钙、去蛋白处理得到的产物，抗原性消除或大大降低，且保留了诱导软骨形成的生长因子和胶原等基质，有利于细胞增殖和分化. DBM为多孔海绵样结构，可提供宽大空间容纳大量的种子细胞，利于细胞黏附、细胞外基质沉淀、营养和氧气的进入以及代谢产物的排出. DBM植入缺损部位后第四周开始吸收，完全吸收需8～12 wk，而软骨形成需6～8 wk，因此DBM吸收和软骨形成几乎同步. 根据修复部位的不同可调整脱钙时间，或部分脱钙和表面脱钙，能适应不同部位的生物力学强度要求. 按修复缺损的形状可剪成不同的形状和大小，应用方便. 同种异体DBM制备方法相对简便可大量获取，低温下可长期保存建立DBM骨库备用. 因此，DBM是一种理想的软骨组织工程支架材料［4，15］.
BMSCs和软骨细胞共培养，两种细胞相互促进增殖和分化，作为种子细胞可减少软骨细胞增殖传代次数并节省软骨细胞数量，与DMB复合能有效修复关节软骨缺损，为优化种子细胞源提供了实验依据，但是共培养的两种细胞间相互作用的机制及其调节机制尚不清楚，并且本实验的动物模型是在正常关节面上造成缺损区进行的修复，有别于临床上常见的大面积不规则缺损，因此对这些问题需要进一步研究和改进.
【参考文献】
［1］ 刘松波，胡蕴玉，徐虎，等. 柱形藻酸钙载体复合细胞修复异体兔膝关节软骨缺损［J］. 第四军医大学学报，2001，22 (11):1010-1013.
［2］ Marlovits S， Hombauer M， Truppe M， et al. Changes in the ratio of typeⅠand typeⅡcollagen expression during momolayer culture of human chondrocytes［J］. J Bone Joint Surg(Br)， 2004，86（5）:286-295.
［3］ Rubio D， GarciaCastro J， Martin MC， et al. Spontaneous human adult stem cell transformation［J］. Cancer Res， 2005，65（6）:3035-3039.
［4］ 李强，孙正义，王栓科，等. 骨髓间充质干细胞复合脱钙骨基质修复兔膝关节全层软骨缺损的实验［J］. 第四军医大学学报，2004，25（15）:1375-1378.
［5］ Pineda S， Pollack A， Stevenson S， et al. A semiquantitative scale for histologic grading of articular cartilage repair［J］. Acta Anat (Basel)， 1992，143（3）:335-340.
［6］ Vats A， Tolley NS， Polak JM. The stem cell in orthopaedics surgery［J］. J Bone Joint Surg(Br)， 2004，86（2）:159-163.
［7］ Tsuchiya K， Chen G， Ushida T， et al. The effect of coculture of chondrocytes with mesenchymal stem cells on their cartilaginous phenotype in vitro［J］. Mater Sci Eng， 2004，24:391-396.
［8］ 周广东，苗春雷，王晓云，等. 软骨细胞与骨髓基质细胞共培养体外软骨形成的实验研究［J］. 中华医学杂志，2004，84（20）:1716-1720.
［9］ Goldberg AJ， Lee DA， Bader DL， et al. Autologous chondrocytes implantation: Culture in a TGFβcontaining medium enhances the reexpression of a chondrocytic phenotype in passaged human chondrocytes in pellet culture［J］. J Bone Joint Surg(Br)， 2005，87（1）:128-134.
［10］ Jakob M， Demarteau O， Schafer D， et al. Specific growth factors during the expansion and redifferentiation of adult human articular chondrocytes enhance chondrogenesis and cartilaginous tissue formation in vitro［J］. J Cell Biochem， 2001，81（4）:368-377.
［11］ Rosier RN， OKeefe RJ， Crabb ID， et al. Transforming growth factor beta: An autocrine regular of chondrocytes［J］. Connect Res， 1989，20(4):295-301.
［12］ Sekiya I， Vuoristo JT， Larson BL， et al. In vitro cartilage formation by human adult stem cells from bone marrow stroma defines the sequence of cellular and molecular events during chondrogenesis［J］. Proc Natl Acad Sci USA， 2002，99（5）:4397-4402.
［13］ Shapiro F， Koide S， Glimcher MJ. Cell origin and differentitation in the repair of fullthickness defects of articular cartilage［J］. J Bone Joint Surg(Am)， 1993，75（5）:532-553.
［14］ Im GI， Kim DY， Shin JH， et al. Repair of cartilage defect in the rabbit with cultured mesenchymal stem cells from bone marrow［J］. J Bone Joint Surg(Br)， 2001，83（2）:289-294.
[关键词]祁州漏芦；H2O2；氧化应激；凋亡；HepG2
[Abstract]To study the inhibitory effect of Rhaponticum uniflorum on apoptosis induced by H2O2 in HepG2 cells Human HepG2 cells injury models were established by H2O2， then cell survival rate was assayed by MTT method； levels of LDH， ALT， and AST were detected by chemical colorimetric method；SOD activity was detected by xanthine oxidase method； GSH content was detected by dithiobisnitrobenzoic acid（DTNB）； MDA level was detected by thiobarbituric acid （TBA） method；and the relative activities of Caspase3， 8 and 9 were measured by Colorimetry The expression levels of Cleaved Caspase3（Casp3）， cytochrome（Cyto c）， NFκB， ERK， JNK， p38 MAPK， as well as the phospharylated proteins were determined with Western blotting method The results showed that R unifloru had no significant effect on cell viabilities of HepG2 cells at the concentrations of 25400 mg・L-1 However， H2O2decreased the cell viabilities， increased the cellular oxidative stress， and upregulated the protein expressions of Casp3， cytoplasmic Cyto c， pJNK and nuclear NFκB As compared with the model group，R unifloru could increase the cell viability， reduce LDH， ALT and AST leakage， reduce the MDA formation， increase the SOD and GSH levels，reduce the relative activities of Caspase3， 8 and 9， downregulated the protein expressions of Casp3 and cytoplasmic Cyto c， and downregulate the pJNK and nuclear NFκB levelsThe results indicated that R unifloru had the inhibitory effect on apoptosis induced by H2O2in HepG2 cells， and the mechanism maybe associated with inhibiting JNK activation and NFκB nuclear translocation
[Key words]Rhaponticum unifloru； H2O2； oxidative stress； apoptosis； HepG2
近年砀尾》⑸率的逐年上升已经引起社会的关注，而活性氧引发的肝细胞氧化应激是多种肝病发生的重要机制之一，因此，探讨如何有效缓解氧化应激损伤对肝病的防治具有重要意义[1]。祁州漏芦是菊科植物Rhaponticum uniflorum （L） DC的干燥根，是一味常用中药。广泛分布于我国内蒙古、东北、山东等地区，药源丰富。它性味咸、苦、寒，能清热解毒，消肿排毒，通乳汁；主治于乳汁不通、淋巴结结核、风湿性关节炎、痔疮等[23]。近年来研究发现，祁州漏芦具有提高机体免疫、抗动脉硬化、抗脂质过氧化、抗衰老、抗炎等作用[46]。课题组研究还发现，祁州漏芦具有良好的保肝作用，能预防多种因素引起的肝损伤，如，可抑制四氯化碳、氨基半乳糖所致化学性肝损伤以及对乙酰氨基酚所致药物性肝损伤等[79]。本实验通过建立H2O2致HepG2细胞损伤模型，预防性给药后观察祁州漏芦水提物对氧化损伤所致凋亡以及凋亡相关蛋白表达的变化，以便探讨祁州漏芦肝细胞损伤的保护作用机制，为祁州漏芦的保肝作用研究提供参考。
1材料
11药物与试剂将祁州漏芦切碎后加水煎煮，滤液经减压蒸馏即得祁州漏芦提取物（RU）干品，主要成分为多糖（81%）和甾酮（12%）[6]；用无血清培养液配成所需浓度，过滤除杂除菌备用。人HepG2肝癌细胞购自南京凯基生物有限公司。DMEM培养基、胎牛血清购自Gibco公司；MTT购自SigmaAldrich公司； LDH，ALT，AST，MDA，GSH，SOD试剂盒购自南京建成科技有限公司；Caspase3，8，9检测试剂盒、线粒体/细胞核制备试剂盒购自江苏凯基生物技术股份有限公司；兔NFκB p65多克隆抗体、兔pNFκB p65多克隆抗体、小鼠ERK多克隆抗体、兔pERK多克隆抗体、兔JNK多克隆抗体、兔pJNK多克隆抗体、兔p38多克隆抗体、兔pp38 MAPK多克隆抗体购自Abcam公司；兔Cleaved Caspase3（Casp3）单克隆抗体、兔细胞色素c（Cyto c）单克隆抗体购自Cell Signaling公司。
12仪器二氧化碳培养箱（美国Shellab公司）；台式高速冷冻离心机（德国Eppendorf公司）；酶标仪（深圳雷杜公司）；垂直版电泳仪及转印槽（美国BioRad公司）；凝胶成像分析仪（美国UVP公司）。
2方法
21细胞培养及传代细胞培养和传代按常规方法进行，含10%胎牛血清的DMEM高糖培养基，37 ℃，5%CO2的饱和湿度培养箱中培养，取对数生长期细胞用025%胰蛋白酶溶液消化进行传代[10]。
22RU试验剂量的确定细胞接种于96孔板中培养12 h后，正常组换成无血清培养液；其余6组为药物组，加RU溶液使其质量浓度分别为25，50，100，200，400，800 mg・L-1。继续培养24 h，吸出培养液，加入MTT溶液，MTT法检测细胞存活率。另设空白孔（只加RU溶液）以排除药物干扰[10]。以细胞存活率（100±5）%为标准确定RU安全浓度[1011]。细胞存活率=（实验组-空白组）/（正常组-空白组）×100%。
23细胞损伤模型的建立和细胞存活率的检测细胞接种于96孔板，培养12 h细胞全部贴壁后，分为正常组、模型M及RU高、中、低剂量组（分别为RU 200，RU 100和RU 50组，质量浓度分别为200，100，50 mg・L-1）。RU组加入相应的含药培养液，孵育24 h；正常组和模型组加入无血清培养液继续孵育24 h；除正常组外，其余组加入300 μmol・L-1 H2O2造模[12]。MTT法检测细胞存活率。
24细胞培养液中LDH，ALT，AST释放的检测细胞分组、造模和给药按23项方法。按试剂盒说明书检测培养液中LDH，ALT，AST的活性。
25细胞MDA，GSH生成和SOD活性的检测按23项方法将细胞在6孔板中分组、造模和给药。细胞用025%的胰酶消化，收集细胞并裂解，离心取上清。按照试剂盒说明书检测细胞MDA，GSH水平和SOD活性。
26细胞Caspase3，8，9的相对活性的测定裂解细胞，离心取上清，并按照试剂盒说明书测定细胞Caspase3，8，9的相对活性。
27细胞Casp3，Cyto c，NFκB，ERK，JNK，p38蛋白及其磷酸化蛋白水平的检测收集和裂解细胞，并提取细胞总蛋白。每组以20 μg蛋白进行SDSPAGE电泳分离，转移至PVDF膜上。用脱脂奶粉封闭，加一抗孵育过夜，加HRP标记二抗孵育1 h，加ECL试剂显色，采集图像并进行灰度比值分析[67]。
28统计学处理数据以±s表示，采用SPSS 190统计软件，采用单因素方差分析及t检验进行数据处理。
3结果
31RU对HepG2细胞生长的影响随着RU浓度的升高，细胞存活率呈升高趋势；质量浓度介于50～400 mg・L-1时，HepG2细胞存活率为100%～105%，对细胞生长无显著影响；当质量浓度为800 mg・L-1时，细胞存活率为107%，与正常组比较差异显著（P
32RU对细胞存活率以及LDH，ALT，AST释放的影响正常组的HepG2细胞生长良好，培养液中3种酶活性不高，说明正常组细胞没有受到损伤；H2O2损伤后HepG2细胞存活率仅为正常组的54%，与正常组比较显著降低（P
33RU对细胞MDA，GSH水平和SOD活性的影响与正常组比较，模型组细胞SOD活性和GSH含量显著降低（P
34RU对Caspase3，8，9相对活性的影响与正常组比较，模型组细胞Caspase3，8，9的相对活性显著增高（P
35RU对细胞Casp3 p17和胞浆Cyto c蛋白水平的影响蛋白印迹结果显示，与正常组比较，模型组细胞Casp3 p17和胞浆Cyto c蛋白水平显著增高何鑫等：祁州漏芦通过下调JNK和NFκB抑制H2O2致肝细胞凋亡
36RU对细胞MAPK磷酸化的影响H2O2不影响3种MAPK总蛋白水平，对p38磷酸化水平也无显著影响，但上调ERK和JNK磷酸化水平（P
37RU对细胞NFκB磷酸化和核转位的影响
4讨论
在肝损伤发生发展过程中，氧化应激是重要环节。因此，寻找对抗肝脏氧化应激的药物，可作为治疗肝损伤关键途径之一[11]。祁州漏芦为传统中药，其保肝作用研究已有一定积累[79]。本试验以人HepG2肝癌细胞构建H2O2诱导的氧化应激损伤模型，研究祁州漏芦的抗肝细胞损伤作用，为阐明祁州漏芦保肝机制提供参考。
当肝细胞受到H2O2诱导的氧化应激损伤时，细胞存活率和细胞毒性是反映细胞受损程度的重要指标。而LDH，ALT，AST作为肝细胞稳定的胞内酶，培养液中其活性升高是检测肝细胞毒性的重要指标之一[1113]。本实验结果显示，祁州漏芦干预可降低细胞毒性，提高细胞存活率，对H2O2诱导的肝细胞损伤具有保护作用。
在H2O2诱导的细胞损伤中，氧化应激是重要损伤机制。肝细胞受损后产生的过量活性氧自由基，攻击生物膜，引发脂质过氧化，使过氧化物水平增高，因此MDA可以反映组织细胞受自由基攻击的严重程度[1113]。本实验结果表明，祁州漏芦干预可升高细胞SOD活性和GSH含量；降低细胞MDA生成，提示，祁州漏芦可通过减轻H2O2诱导的肝细胞氧化应激而达到抑制肝细胞损伤。
氧化应激损伤同样会诱导肝细胞发生凋亡。氧化应激损伤中产生的过量活性氧会损伤功肝细胞线粒体，使其释放Cyto c，继而活化Caspase家族，并最终导致细胞凋亡[14]。Caspase级联反应是推动细胞凋亡程序的核心事件，其中Caspase9为内源性的线粒体凋亡途径的关键酶，Caspase8为外源性的死亡受体途径的关键酶，二者分别在细胞凋亡的2条主要途径中起作用，而Caspase3则为凋亡的执行者，是2条凋亡通路的共同环节，因此是凋亡发生的标志酶[1314]。本研究显示，H2O2上调Casp3和胞浆Cyto c蛋白表达，增高肝细胞Caspase3，8，9相对活性，而祁州漏芦干预可下调Casp3和胞浆Cyto c蛋白表达，降低肝细胞Caspase3，8，9相对活性。提示，祁州漏芦抑制H2O2诱导的肝细胞凋亡，至少与Cyto c释放引起的线粒体途径相关，死亡受体途径的参与还需进一步探讨。
氧化应激还可通过多个通路增强MAPK磷酸化而导致细胞凋亡或乃阑因的激活或改变[15]。MAPK通路是细胞外信号到细胞内的主要信号通路，ERK普遍认为是“细胞生存”通路，JNK通路则形成调控细胞增殖和凋亡的一个复杂网络，存在协同和拮抗的现象，p38调控炎症反应，调节NFκB活化[16]。NFκB是一种具有多向转录调节作用的蛋白因子，其与肝细胞损伤的关系一直是肝脏疾病研究中的热点[17]。研究证实，活性氧可以直接激活NFκB转移入细胞核，诱导靶基因的转录，促进各种炎症介质释放而导致肝细胞炎症，诱发肝细胞凋亡[17]。本研究结果显示，H2O2上调ERK，JNK和NFκB磷酸化以及NFκB核转位水平，而祁州漏芦干预可下调JNK磷酸化和NFκB核转位水平，对ERK和NFκB磷酸化水平无显著影响。提示，祁州漏芦可能是通过抗JNK激活和NFκB核转位作用而抑制肝细胞凋亡的。祁州漏芦抗细胞凋亡作用中NFκB和JNK之间的关联、以及线粒体凋亡通路之间的关系需进一步研究。
综上所述，祁州漏芦对H2O2所致HepG2细胞凋亡具有抑制作用，其作用可能与其抗JNK激活和NFκB核转位作用有关。
[参考文献]
[1]韩延忠，周永峰，桑秀秀，等 氧化苦参碱对H2O2诱导L02细胞损伤的抑制作用及其机制的研究[J] 中国中药杂志，2016， 41（7）：1302
[2]全国中草药汇编编写组 全国中草药汇编. 下册[M] 2版.北京：人民卫生出版社，1996：919
[3]金爱花 漏芦对小鼠H22肝癌皮下移植瘤的抑制作用及机制研究[D] 延吉：延边大学，2011
[4]邹莉波，于庆海，蔡虹 祁州漏芦抗氧化作用的实验研究[J]. 沈阳药学院学报，1992， 9（1）： 73
[5]张学武，李天洙，孙权 漏芦提取物抗炎、镇痛、耐缺氧及抗疲劳作用的研究[J] 四川中医，2005， 23（7）： 45
[6]李勇，金明，全吉淑 漏芦水提取物抗脂质过氧化活性分析[J] 中国公共卫生，2011， 27（10）： 1338
[7]宋昊，赵文玺，王玉娇，等 祁州漏芦对四氯化碳所致肝脏氧化应激和DNA损伤的影响[J] 中国药学杂志，2013， 48（22）：1915
[8]宋昊，朱Z，金梅花，等 祁州漏芦不同溶剂提取物对急性肝损伤模型小鼠的保护作用[J] 中国药房，2014， 25（3）：205
[9]金明，高峰，金梅花，等 祁州漏芦对D氨基半乳糖所致小鼠急性肝损伤的保护作用[J] 食品研究与开发，2016， 37（2）：1
[10]刘春彦 漏芦对H2O2诱导的HepG2细胞损伤的保护作用[D] 延吉：延边大学，2012
[11]韩林，李健，林欣，等 黄芪甲苷对Chang Liver细胞酒精性和非酒精性氧化损伤的保护作用[J] 中国中药杂志，2014， 39（22）：4430
[12]金明，王玉娇，金梅花，等 两种细胞建立肝细胞氧化损伤模型比较[J] 中国公共卫生，2015， 31（3）：324
[13]贺兰芝，孟雅坤，韩延忠，等 木犀草素对对乙酰氨基酚诱导的L02肝细胞损伤的保护作用[J] 中国中药杂志，2016， 41（22）：4234
[14]董曦，孙桂波，罗云，等 异鼠李素对H2O2引起的H9C2细胞氧化应激损伤的保护作用研究[J] 中国药理学通报，2015， 31（6）：853
[15]吴娜，蔡光明，何群 氧化应激与肝脏损伤[J] 世界华人消化杂志，2008， 16（29）：3310
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