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【关键词】噬菌体生物扩增法;聚合酶链反应技术;结核;分枝杆菌
【中图分类号】R378.91+1【文献标识码】A【文章编号】1007-8517(2010)16-159-2
结核分枝杆菌感染人体而引发的结核病是全球性的严重危害人类的传染性疾病之一。我国作为发展中国家,结核病的控制更是任重道远。在结核病控制中,寻求经济,快速,敏感性和特异性较高的结核菌检测方法,为结核的早期诊断提供依据是众多临床医师所希望。目前痰荧光涂片灵敏度较差,并受痰样本数和病情的影响,一般认为活动性肺结核涂阳率约40-50%[1];罗氏培养法阳性率较高约50-80%[1],但需要平均时间约4-8周。本研究通过PhaB法、荧光涂片法、PCR检测法、罗氏培养法检测肺泡灌洗液中结核分枝杆菌,通过对照评价PhaB法在肺结核诊断中的使用价值及优缺点。
1资料与方法
1.1临床资料选取2008-2010年广州市胸科医院疑诊初治肺结核住院患者80例,其中男性35例,女性25例,年龄19～65岁,平均年龄38.5±7.5岁。入选条件:疑诊为初治肺结核并支气管结核,未开始抗结核治疗;三个月内未接受喹诺酮类和氨基糖甙类抗生素治疗。
1.2方法
1.2.1PhaB法结核分枝杆菌噬菌体生物扩增试剂盒(FAST plaue TB)由英国BDTEC公司生产,由上海市金浩科技发展有限公司提供。
1.2.2支气管冲洗液标本收集按支气管镜检查常规进行术前准备和麻醉,通过胸部CT或胸片初步确定重点检查部位。气管镜经鼻腔进入,通过声门逐步检查气管,支气管。对镜下可见病变部位,可先后进行支气管粘膜活检和支气管刷检,随后进行支气管冲洗,将生理盐水5～10毫升注入相应的肺叶和肺段病变部位进行冲洗,用吸引器将冲洗液收集入标本瓶中送检,共2-3次。对镜下病变部位不明显处,将纤支镜插入病灶最多部位所在的支气管开口按上述方法进行刷检、冲洗,留取标本。
1.2.3噬菌体生物扩增法按试剂盒(FASTPlaqueTBTM)说明书配制所需试剂,包括培养基-生物添加剂、琼脂、噬菌体和敏感细胞等,全部操作在无菌操作台进行。肺泡灌洗液洗标本的处理:取灌洗液标本5ml,加入1倍体积的4%NAOH溶液混匀常温静置15min去污染。加入磷酸缓冲液(PH6.8)离心20min,弃去上清液。重悬沉淀物,4000g离心15min,弃去上清液,重悬沉淀物,无菌条件下吸取1ml重悬液加入孵育管中,37℃孵育24小时。检测:每次取1ml处理后的样品加入各反应管中,阴性对照不加标本,阳性对照加入1:1000稀释度的敏感细胞液。加入100ul噬菌体溶液在37℃条件下培育1h。在每个反应管中加入100ul强效杀毒剂溶液,上下充分混匀,室温放置5min后加入5ml培养基-生长添加剂和1ml敏感细胞液。将反应管中所有反应混合物倒入培养皿中,加入5ml融化的琼脂,快速混匀静置成型。37℃温育18-24小时后观察结果。结果判断:噬菌斑数19个阴性,20个位阳性。
1.2.4其他检测方法荧光涂片法:用金胺“O”荧光染色涂片法,荧光显微镜检每50个视野≥10-99条抗酸杆菌为阳性;结核菌培养:用BacT/Alert3D全自动分枝杆菌快速培养仪按照仪器使用说明书进行临床标本的分离培养;荧光定量聚合酶链反应技术(PCR检测):检测冲洗液结核分枝杆菌DN段,TB-DNA基因拷贝数量>1×103拷贝/mL阳性
1.2.5统计学处理采用SPSS统计软件进行分析,用X2检验比较不同检测方法的阳性率,P
2结果
初步诊断为肺结核合并支气管内膜结核的,未予抗痨治疗的纤支镜肺泡灌洗液标本80例。使用PhaB法、荧光涂片法、PCR检测法、罗氏培养法四种检测方法,PhaB法阳性率58.8%,荧光涂片法阳性率为47.5%,PCR检测法阳性率65%,快速培养法阳性率76.3%。其中,PhaB法检测阳性率明显高于荧光涂片法,检验差异有显著性意义(X2=4.27,P0.05),提示两者阳性检出率类似;PhaB法与罗氏培养法比较检验有显著性差异(X2=12.07,P0.05)。
表一 80例初步诊断肺结核肺泡灌洗液使用PhaB法、荧光涂片法、PCR检测法、罗氏培养法进行检测阳性结果
方法 标本例数 阳性例数 阳性检出率(%)
①PhaB法 80 47 58.8
②荧光涂片法 80 38 47.5
③PCR检测 80 52 65
①③两种方法联合 80 58 72.5
④罗氏培养法 80 61 76.3
PhaB法检出的47份阳性标本中,荧光涂片法检出35例阳性;PhaB法检出的33份阴性标本中,荧光涂片法检出30例阴性。PCR法检测的52份阳性标本中,PhaB法检出41份,检出率78.8%;罗氏培养法阳性的61例标本中,PhaB法检测出44份,检出率72.1%。
表二 80例初步诊断肺结核肺泡灌洗液使用PhaB法、荧光涂片法、PCR检测法、罗氏培养法进行检测结果比较
荧光涂片法 PCR检测法 罗氏培养法
阳性 阴性 阳性 阴性 阳性 阴性
PhaB法 阳性(n=47) 35 12 45 2 47 0
阴性(n=33) 3 30 7 26 14 19
合计 38 42 52 28 61 19
3讨论
1997年wilson等[2]人发现众多的噬菌体中有一种分枝杆菌噬菌体能感染结核分枝杆菌和少数几种非结核分枝杆菌。在经过处理的标本中加入结核分枝杆菌噬菌体,使噬菌体和分枝杆菌结合,随后加入杀毒剂灭活未感染分枝杆菌的噬菌体。噬菌体在受感染的分枝杆菌内,利用其代谢酶系进行大量繁殖。当分枝杆菌破裂,大量的子代噬菌体被释放,感染加入的敏感指示细菌,在培养基上经培养形成噬菌体空斑。当空斑数量>20个为阳性,否则为阴性。阳性的标本间接提示原标本有结核分枝杆菌或少数的几种非结核分枝杆菌。这构成了噬菌体法检测分枝杆菌的理论基础[3]。据国外资料报道,2002年南非Albert[4]等人对疑似肺结核患者,以罗氏培养法为金标准,噬菌体法对痰标本检测的敏感性73%,特异性为99%;巴基斯坦Muzaffar[5]等人用类似方法测得噬菌体法的敏感性82%,特异性98%;国内于秀丽[6]等人用BACTEC MGIT980快速培养法作为金标准,测得噬菌体法检测痰中结核分枝杆菌的敏感性为86.4%,特异性83.9%。均显示噬菌体法对痰中分枝杆菌检测有较高的敏感性和特异性。
本研究用噬菌体生物扩增法、荧光涂片法、聚合酶链反应技术、罗氏培养法共4种方法同时检测不同的纤支镜肺泡灌洗液标本80份。PhaB法、荧光涂片法、PCR检测法、罗氏培养法阳性检出率分别为58.8%,47.5%,65%,76.3%。PhaB法和荧光涂片法阳性率比较,差异有显著性意义(X2=4.27,P0.05);噬菌体生物扩增法以罗氏培养法为金标准,结果提示其敏感性77%,特异性100%,阳性预测值100%,阴性预测值57.6%。和国外以痰标本PhaB法检测报道结果相似[4]。联合PhaB法和荧光涂片法检测敏感性为81.2%,特异性为100%,阳性预测值100%,阴性预测值57.6%;联合PhaB法和PCR检测法检测敏感性为88.5%,特异性为89.5%,阳性预测值96.3%,阴性预测值89.5%。提示联合PhaB法和PCR检测法,能快速诊断肺结核,有较高的敏感性和特异性,在临床中可能有较大的实用价值。这有待于更大的标本量进一步验证。
结核分枝杆菌细菌学检测是诊断结核的金标准之一,但患者排菌情况受结核病发现时期较大影响,对早期以渗出、增殖为主的病理改变,排菌量较小;而发生坏死,空洞形成的患者相对排菌量较大。同时病灶相连的支气管引流是否通畅也影响远端气管内分泌物的排出,影响到痰结核菌的检查。本组病例肺泡灌洗液标本PhaB法阳性检测率较高,除了与病例的选择有关,考虑原因:支气管镜检查对支气管、肺泡的机械性刺激,活检钳和毛刷损伤支气管壁和病灶边缘,同时在在纤支镜活检和刷检后灌洗可起到疏通支气管,促进远端分泌物的排出。用生理盐水在病变部位注入远端气道和肺实质,接触病灶范围较广,负压吸引收集冲洗液较多,细菌量较大,深部的结核菌可能被收集到冲洗液中。肺泡灌洗液对支气管有刺激作用,可以诱发部分患者咳嗽,有利于深部结核菌的排出,获得结核菌的机会增多[7]。另外,PhaB法是通过噬菌体感染结核分枝杆菌,而结核分枝杆菌受一些理化因素作用,表面受体发生细微变化可能导致不能被噬菌体感染[8]。相对痰标本,肺泡灌洗液标本受理化因素影响较小。
总结噬菌体生物扩增法对肺泡灌洗液标本分枝杆菌检测的临床应用。PhaB法操作简便,获取结果快速(2天),相对荧光涂片法有较高的敏感性和特异性。对PhaB法分枝杆菌检测高特异性,临床可以用于结核杆菌和非结核分枝杆菌的菌种鉴定[9]。针对噬菌体必须感染活的结核菌特性,临床中还可以对标本加入不同的结核药,对照不加药标本,筛查结核菌株对不同结核药的耐药性[2]。
参考文献
[1] 马屿,朱莉贞,潘毓萱.结核病[M].北京:人民卫生出版社,2006:103-108.
[2] WLSON SM,ALSUWADIZ,MCNERNEYR,et al Evaluation of an new rapid bacteriophage-base medthod for the drug susceptibility testing of Mycobacterium tuberculosis[J].Natmed,1997,3:465-469.
[3] 彭丽,罗永艾,王国治.噬菌体生物扩增法快速检测结核分枝杆菌标准化研究[J].中华结核和呼吸杂志,2004,27(12):806-810.
[4] ALber H,Heydenrych A,Brookes R,et al Performance of a rapid phage-based test,FAST Plaque TBTM,to diagnose pulmonary tuberculosis from sputum specimens in South Afica[J].Int J Tuberc Lung Dis,2002,6:529-537.
[5] Muzaffar R,Batool S,Aziz F,et al Evalution of the FAST Plaque TB assay for direction of mycobacterium tuberculosis in sputum specimens[J].Int J Tuberc Lung Dis,2002,6:635-640.
[6] 于秀丽,王秋月,李艳玲.噬菌体生物扩增法快速检测痰结核分枝杆菌的临床研究[J].中国实用内科杂志,2007,27(11):1697-1699.
[7] 常占平,彭勋,王洪芬,等.纤维支气管镜检查对无痰或痰菌阴性不典型肺结核的诊断价值[J].中华临床医师杂志,2008,2(8):922-926.
【关键词】淋病奈瑟菌；沙眼衣原体；解脲支原体；检测分析
文章编号：1009-5519（2008）13-1962-02 中图分类号：R446 文献标识码：A
我们于2000~2002年对自述泌尿生殖道感染的门诊患者开展了淋病奈瑟菌（NG）、沙眼衣原体（CT）及解脲支原体（UU）的检查，现将结果报道如下。
1 材料与方法
1.1 标本来源:按常规方法女性取宫颈分泌物，男性取尿道分泌物、前列腺粹等标本。近3年来在我院门诊就诊患者共获取泌尿生殖道标本5 008份，其中男性标本2 759份，女性标本2 249份。
1.2 实验材料
1.2.1 试剂：TM淋病奈瑟菌分离培养基（浙江军区卫生防疫站）；解脲支原体液体培养基（广州万孚生物研究所）；单克隆抗体免疫荧光法沙眼衣原体特异性诊断试剂盒（军事医学科学院病毒所）；革兰氏染液（自配）。
1.2.2 器材：消毒男性拭子及女性拭子、载玻片、甲醇、染色湿盒。
1.2.3 仪器： 孵育箱、荧光显微镜、光学显微镜，旋转式振荡器。
1.3 方法：接种：将消毒棉拭子所有的标本按淋病奈瑟菌，沙眼衣原体及解脲支原体的顺序依次接种。（1）在TM培养基上分区划线；（2）再将标本涂在无菌的载玻片上，以甲醇固定10 min，取出后于空气中充分挥发；（3）最后将取有标本的棉拭子放于解脲支原体液体培养基中轻轻搅动后取出。
1.3.1 分离培养和鉴定：（1）接种后将TM培养基置于37 ℃，5%~10% CO2环境下孵育，18~24 h后，可形成直径约0.5~1 mm、灰白色、光滑、半透明、呈露滴状的圆形凸起菌落。可疑菌落先用氧化酶（+）试验证实，然后作生化和免疫鉴定。（2）将固定在玻上的标本加抗衣原体荧光抗体25 uI，放入湿盒中，密盖，置37 ℃温箱孵育30 min，用含吐温80的磷酸盐缓冲液入洗槽中，放旋转式振荡器振荡洗涤5 min，共3次，吹干，滴缓冲甘油作镜油，于荧光显微镜下检查。查见亮绿色，具有典型大小，边界清晰的圆形颗粒、柱状细胞内可见亮绿色包涵体，可报告“衣原体荧光抗体染色阳性”。（3）解脲支原体液体培养基置于35 ℃孵育24 h，观察液体呈红色清亮即为阳性；若不变色，再放24 h观察，红色、清亮为阳性，不变色为阴性。（4）将已固定的细菌涂片，按常规革氏染色后镜检。若男性急性尿道炎患者的脓性分泌物中呈现中性粒细胞内外有G-双球菌，可报告为“查见G-双球菌（细胞内外），”具有诊断价值。
2 结果
2.1 近3年来共计检测标本5 008份，男性2 759份，3种病原体阳性共633份，检出阳性率22.9%；女性2 249份，3种病原体阳性共433份，检出阳性率19.3%。
2.2 1 006份阳性标本中，患者年龄分布：40岁104例占9.8%。3种病原体在不同性别人群中的检出结果见表1。
2.3 在检出的1 006例中NG阳性218例占20.5%，CT阳性196例占18.4%，UU阳性652例占61.1%。
2.4 各种病原体混合感染情况：NG与CT混合感染为18例，阳性感染率1.7%，其中男8例，女10例。NG与UU混合感染37例，阳性感染率3.5%，其中男13例，女24例。CT与UU混合感染为30例，阳性2.8%，其中男20例、女10例。NG、UU与CT混合感染为1例。
3 讨论
3.1 随着国内外交往日益频繁，性意识和的改变，性传播疾病已成为常见疾病，因此，开展性病防治、性病监测及开展新的检测技术早期诊断，提高检出率是卫生工作者的重点。
3.2 由于男、女生理上的差异，淋病在男性的临床特征明显，在门诊直接用脓液涂片革兰氏染色，阳性检出率可达90%以上，无需再做细菌培养。而女性淋病患者，细菌培养有十分重要的意义。
3.3 本文对3年来我院性病门诊疑为泌尿生殖道感染患者5 008例。分别或同时进行NG、CT、UU的检测，病原检测阳性者1066例，占被检人数的21.3%，阳性率由高到低为UU（13%）>NG(4.4%)>CT(3.9%)。UU与NG、CT有显著性差异（P
3.4 三种病原体的检出中，阳性检出的最小年龄为4岁，最大为70岁，青壮年是阳性检出的主体；大多集中在20~40岁，占总检出标本的81.1%。应加强这一年龄段的健康教育，以提高人们的文化素质、法制观念、性道德观念以及健康知识和自我保护意识[2]。
3.5 从表1可见，淋病奈瑟菌、沙眼衣原体及解脲支原体混合感染普遍，所以对尿道炎患者应同时进行三项联检测，防止漏诊或误诊现象出现。
参考文献：
[1] 于中丽，党 肯.非淋球菌性病尿道炎病原体构成分析[J].陕西医学检验，2000，15（1）：19.
关键词：布鲁氏杆菌；免疫磁珠；优化选择性培养基
中图分类号：S85 文献标识码：A DOI：10.11974/nyyjs.20160932027
布鲁氏杆菌，是马耳他热和波浪热的病原菌，每年患者人数不断增加，成为流行病学中高度关注的致病源。布鲁氏杆菌主要通过畜产品和皮毛加工及养殖接触传染，寄生于细胞内，引起机体免疫力下降，可以导致患者丧失劳作能力和流产等，是食源性疾病中增长较快的一类致病源[1]。目前活菌培养依然是最好的评价布鲁氏杆菌感染的方法，只要在标本中检出，就可以确定食品的安全性并对布鲁氏杆菌污染实现追踪溯源。
1 材料与方法
1.1 Dynabeads M-280磁珠 （日本DYNAL社产）
EDC solution 液；NHS solution液；BST溶液；MEST洗液；羊布鲁氏杆菌；羊布鲁氏血清；羊抗兔Ig；马血清；赤藓醇；白细胞介素2；胰蛋白；葡萄糖；烟酸；生物素；维生素B1；D-环丝氨酸 ；甲基乙醚；多黏菌素B；杆菌肽；放线菌酮；制霉菌素；琼脂粉。
1.2 磁珠的偶联
将2mg 磁珠加入2mL Eppendorf管中，管中加入500uL MEST对磁粒子进行洗涤3次。加入EDC与NHS各2.5mg，调整反应体积为500uL，混匀后37℃恒温活化0.5h，用MEST洗涤除去未反应的活化剂，换管洗涤2次。再用BST液洗涤2次，分散到BST中。加入抗血清300 uL，调整反应体积为500uL，4℃偶联20h。用BST液洗涤4次，500μL保存液重悬偶联好的抗体磁珠。
Dynabeads M-280 磁珠时用下列方法处理：取羊抗兔 Ig （G）0.5 mL，加1 mL PBS-Tween溶液混匀。离心，弃去上清液。再加1 mL PBS-Tween 液使磁珠重新分散悬浮其中。加羊布鲁氏杆菌免疫血清1mL，4℃垂直于水平面、旋转振荡18h。上磁，弃液体。消磁，用1 mL洗液清洗，重复清洗5次。洗净后免疫磁珠放4℃冰箱备用。
1.3 选择性培养基配置
葡萄糖0.1g；赤藓醇 0.2g；胰蛋白?12g；氯化钠3g；马血清23mL烟酸 0.5 mg；生物素 0.2 mg；维生素B10.5 mg；D-环丝氨酸 321.5mg；甲基乙醚1：20000；多黏菌素B 1：4000；杆菌肽 1：25000；放线菌酮1：100000；制霉菌素10000单位；硫酸锌 2μg；氯化铜1μg；硫酸钴 2μg；三氯化铁27μg；三氯化铝10μg；用蒸馏水定容至1L，pH =6.8。将上述培养基取200 mL添加1.5%琼脂粉，制备成选择性培养基，其余分装成100mL/瓶选择性增菌液。上述培养基在115℃， 20min条件下灭菌备用。
1.4 样品测试
将布鲁氏杆菌肉汤增菌后，用血球计数板法稀释到每毫升含菌1×103CFU/mL，然后取0.1 mL分别添加到100g牛奶、100g羊腿肌肉、100g水样品中，混匀成测试样。
将上述样品分别称取25g于100 mL增菌液中，37℃、5%CO2条件下进行增菌培养24～48h。
1.5 免疫磁珠富集
吸取1mL增菌液，放入含有5mg免疫磁珠管内，室温垂直旋转振荡20min。上磁架，固定磁珠，弃样液。加1mL 洗液复混后同前操作。清洗4～5次后，加100uL PBS-Tween液使免疫磁珠和目标混匀备用。
1.6 选择性分离培养和计数
将免疫磁珠混匀后移入标准一次性平板内，倒入45℃左右选择性培养基，摇匀。或在预先铺好的选择性平板上采用涂布法涂布。将接好种选择性平板在37℃，5%CO2条件下培养24～48h，计数。
1.7 培养结果和比较
挑取10株平板菌落，分别接种在生化管培养，符合以下生化反应的为羊布鲁氏杆菌：革兰氏染色-，触酶+，氧化酶-，葡萄糖-，半乳糖-，阿拉伯糖+，硝酸盐-，尿酶-，精氨酸-，H2S-，硫堇+，明胶-，吲哚-，MR-，VP-，枸橼酸盐-，甘露醇-。
计算公式：布鲁氏杆菌=选择平板总菌落数×（阳性株÷10），结果见表1。
2 讨论
布鲁氏杆菌的检测逐步被分子学检测所代替，但是不可否认分子学也存在着弊端，样品中即便存在布鲁氏杆菌的核酸但未必说明样品具有生物可传染性，经典的活菌培养法在确认布鲁氏杆菌的生物安全性上具有更可靠性。
相比较，采用免疫磁珠联合选择性培养基法检测布鲁氏杆菌可以极大提高布鲁氏杆菌的检出限，这主要得益于优化的培养基丰富了布鲁氏杆菌必须的生长因子及免疫磁珠的富集优势，使得活菌培养法丰富了布鲁氏杆菌的微生物学研究与检验方面实验需要。
参考文献
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在互联网这个最大、最具开放性、最富平等和活力的思想交流平台上，受众作为信息单向接受者的被动地位已经改变，他们毫无拘束地发表自己的意见、要求和愿望，直接参与各种新闻信息和思想观点的传播。受众的参与内容成为主题报道的一个部分，是对报道主题的另一种深化和延伸。受众互动和参与，摒弃了传统媒体单纯的宣传、教育、告知的功能，最大限度地调动起普通受众的参与热情。受众参与的双重性，即心理上的间接参与和行为上的直接参与，又最大程度上刺激了受众的积极性。让读者参与到重大主题报道中来形成互动，能提升重大主题报道的影响力并形成轰动效应。
中国宁波网围绕纪念建军80周年，精心策划了“我是一个兵”八个一系列活动主题集约、形体发散、网民互动。充分发挥网络媒体的及时性、互动性、表现多样等优势，把主题宣传与网民参与有机结合起来，有100多万人次直接和间接地参与了主题活动，得到了当地省市领导部门的高度肯定。
原创征文，回味军旅。在天一论坛、博客开设“我是一个兵”征文专区。受众讲述动人的军旅故事，有退伍军人、军人家属、普通百姓等，征文200余篇，评出优秀征文近20篇。建军感言，真情流露。在天一论坛和手机报纸中开设专栏，向全体网友征集“我对建军节的一句话”。市民通过短信、电话、发帖、邮件等方式参与，共收集到300余条经典感言。军旅照片，精彩纷呈。举办“红色记忆・我眼中的80年”网上原创图片展，征集网友原创贴图，同时制作了专题页面供网友上传图片，共收到作品200多份。军事电影，众人评说。由网友推荐以军事为体裁的优秀电影共75部。最后由网友投票选出了“我最喜欢的军事电影”。广为熟悉的《小兵张嘎》、《上甘岭》、《地雷战》、《平原游击队》、《血战台儿庄》、《地道战》、《闪闪的红星》榜上有名。经典军歌，风采再现。在论坛和网上广播中向广大歌友征集“我最喜爱的一首军歌”，共百名网友用自唱自录，老歌新唱等形式翻唱了革命歌曲。调查互动，体现民心。以“我看军旅生活”为主题，开展一次以军营生活为背景的网络调查，就网民关心的问题开设网上问卷，上万人次参与。创作网刊，深化主题。制作了建军八十周年“我是一个兵”主题网刊，集文字、图片、音乐、视频、互动为一体，刊登各项活动中的优秀作品，回顾系列宣传活动的效果。
受众参与的互换性：
受众参与改变传媒与受众关系，主题参与改变了传媒价值取向
重大主题宣传的受众参与不仅是新闻“三贴近”的具体表现，也是新闻创新的一个原动力。加强主题宣传的创新策划，吸引受众对新闻媒介的关注和对新闻事件、新闻报道全过程的参与是重大主题报道的一个重要内容。受众的参与需求改变了传媒与受众的关系，也改变着媒体的传统价值取向。受众主动参与重大主题报道反映着新闻媒体传播取向的转换和互换。
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