时间：2023-05-16 16:50:37
导语：在干细胞培养技术的撰写旅程中，学习并吸收他人佳作的精髓是一条宝贵的路径，好期刊汇集了九篇优秀范文，愿这些内容能够启发您的创作灵感，引领您探索更多的创作可能。
1 材料和方法:
1. 1 材料
1. 1. 1 主要仪器:CO2培养箱、净化工作台、倒置显微镜、倒置荧光显微镜、共聚焦荧光显微镜、流式细胞仪。
1. 1. 2 主要试剂:DMEM 高糖培养基( Dulbeccosmodified Eagles medium，DMEM)、人表皮生长因子(EGF)、0.25%含 EDTA 的胰蛋白酶(0. 25% trysin-EDTA)、胎牛血清(fetal bovine serum，FBS)、抗生素(penicillin，streptomycin)、PBS 缓冲液购自于 Gibco公司。Oct-4、Sox-2、SSEA-4、nestin、vimentin、BDNF、NGF、CD90 购自与 Abcam 公司。CD29、CD44 购自于 eBioscience 公司、CD45、CD11b 购自于 BD 公司。
1. 1. 3 实验动物:SPF 级孕 18 ～ 18. 5 d 的 SD 大鼠，购自中国军科院实验动物中心，许可证号:[SCXK-(军)2014-0004]，实验动物使用批准号:ILAS-PL-2014-001。在无菌条件下进行实验操作分离羊膜组织。
1. 2 方法
1. 2. 1 羊膜细胞分离及培养:SD 孕鼠腹腔注射 1% 戊巴比妥钠(0. 01 mL /g)，麻醉后，无菌条件下开腹，机械性分离子宫层，剥离胎盘，分离羊膜组织置于含有500 U/mL 双抗的 PBS 溶液中冲洗。将羊膜组织放置在含有500 U/mL 双抗的 DMEM 基础培养基中，无菌眼科剪将其剪至1 mm3左右的小块。将组织悬液移至50 mL 离心管中，1 000 r/min 离心 5min，弃上清液。加入 0. 25% 含 EDTA 的胰蛋白酶10 mL，37℃ ，5% CO2条件下消化 20 ～30 min。用含有10%胎牛血清的完全培养基终止消化。200 目不锈钢滤网过滤单细胞悬液，接种至 25 cm2培养瓶，含10% FBS、10 g/LEGF 和 500 U/mL 双抗的DMEM 完全培养基培养，隔天细胞换液，2 ～ 3 d 后细胞长满培养瓶85% ～90%时，进行细胞传代。
1. 2. 2 流式细胞术检测:取培养 2 ～ 4 代细胞，用0. 25% 含 EDTA 的胰蛋白酶消化，含 10% FBS 的DMEM 完全培养基终止消化。细胞计数将其稀释成1 106个，每个流式管1 mL 细胞悬液。每流式管加2 mL PBS 使细胞混匀，2 000 r/min 离心5 min，弃上清液。重复加2 mL PBS 重悬细胞，2 000 r/min离心5 min，弃上清液。每管加 50 L PBS 重悬细胞，加 抗 体 CD29-PE-Cy7、CD44-PE、CD90-FITC、CD45-PE-CY7、CD11b-APC，避光室温孵育 30 min。每管加2 mL PBS 重悬细胞2000 r/min 离心5 min，弃上清液。各管加300 L PBS 重悬细胞上机检测。
1. 2. 3 免疫荧光细胞染色:取 2 ～ 4 代细胞，0. 25%含 EDTA 胰蛋白酶消化，含 10% FBS 的 DMEM 完全培养基终止消化。加入完全培养基重悬，至24 孔板中培养。待细胞增殖至 70% 作用时，PBS 冲洗，4% 多聚甲醛(预冷)固定 10 min。PBS 冲洗 2 次，每次5 mim。1% Tuiton-100 孵育10 min。PBS 冲洗2 次，每次 5 mim。山羊血清工作液每孔 100 L 室温下封闭30 min。吸去山羊血清工作液，抗体稀释液稀释抗体 Oct-4(1∶ 200)、Sox-2(1∶ 200)、SSEA-4(1∶200)、nestin(1∶100)、vimentin(1∶100)，每孔100L，4℃过夜孵育。PBS 冲洗 3 次，每次 5 min。避光条件下，PBS 稀释 FITC 标记的羊抗鼠二抗(1∶200)，37℃避光孵育 30 min。PBS 冲洗 3 次，每次5 min。DAPI 封片剂封片。共聚焦荧光显微镜观察。
1. 3 统计学方法实验结果采用 x珋 s 表示，使用 SPSS 15.0 统计软件进行统计处理，对其进行单因素方差分析和LSD 检验，P 0. 05 表示差异具有统计学意义。
2 结果
2. 1 分离细胞培养分离培养大鼠羊膜细胞，镜下，细胞呈变形虫样生长(图 1a)，生长速度快(图 1b)，需隔天换液传代。本实验中大鼠羊膜细胞可传至6 ～7 代。
2. 2 流式细胞术鉴定细胞表面抗原结果经流式细胞术鉴定大鼠羊膜细胞间充质细胞表面标记物 CD29、CD44 分别为97. 6%和95. 8%。细胞表面抗原CD90、CD45 几乎不表达，CD11b 有少量表达(图2 见文后彩插6)。
2. 3 细胞免疫荧光鉴定细胞表面标记物结果本实验通过细胞免疫荧光方法检测大鼠羊膜细胞表达干细胞标记物 Oct-4 和 Sox-2(如图 3)，神经干细胞标记物 nestin 和间充质干细胞标记物vimentin(如图 4)，( 图 3 ～ 4 见文后彩插 7) 并表达胚胎干细胞标记物 SSEA-4(如图 5)。可表达神经营养因子 BDNF 和NGF(如图6)(图5 ～6 见文后彩插8)。
3 讨论
通过细胞免疫荧光实验发现大鼠羊膜细胞表达干细胞表面标记物 Oct-4 和 Sox-2，间充质细胞标记物 vimentin 和神经细胞标记物 nestin，表达 SSEA-4。可表达神经营养因子标记物 BDNF 和 NGF，这些神经营养因子是神经元生长与存活所必需的蛋白质分子。羊膜细胞表达间充质干细胞标记物 CD29和 CD44，其表达量均在95%以上，CD45、CD90 几乎不表达，CD11-b 有少量表达。Oct-4 可参与胚胎干细胞的自我更新，调节胚胎干细胞的多分化潜能。有研究指出 Oct-4 在羊膜细胞核内及细胞质均可表达。Miki 等人研究结果表明人羊膜上皮细胞和间充质细胞都可表达 Sox-2、Oct-4 等干细胞标志物。本实验结果显示在大鼠羊膜细胞中 Oct-4 在胞核和胞质中均有表达。Nestin 被认为是在胚胎和成体组织中的多能性神经干细胞的标记物。在有丝分裂活跃的中枢神经系统和周围神经系统细胞中表达，现作为神经干细胞的标记物被广泛应用。人羊膜来源的间充质干细胞经体外诱导分化，可分化为神经样细胞并表达 nestin、Oct-4 和 Sox-2。Vimentin 起到维持细胞形态，胞质完整性和稳定细胞骨架的作用。有研究发现在妊娠 15 d 的大鼠胚胎中检测有nestin 和 vimentin 的表达，人羊膜细胞未分化的前体细胞中也存在 nestin、vimentin 表达。
【摘要】
目的 ：研究糖尿病是否会导致在体外培养条件下自体骨髓间充质干细胞的增殖、分泌和抗凋亡能力的改变。方法：利用链脲佐菌素（STZ）诱导制作成年大鼠糖尿病模型（n=6），正常大鼠作为对照组（n=6），分别于体外利用全骨髓贴壁法来扩增和纯化骨髓间充质干细胞后，取生长良好的第2代细胞作为本实验的研究对象。采用Cell Count kit-8（CCK-8）分别绘制两组细胞的生长曲线来评价增殖能力；采用酶联免疫吸附试验（ELISA）检测血管内皮生长因子（VEGF）和胰岛素样生长因子-1（IGF-1）的分泌量；应用Hoechst33342染色和膜联蛋白V/PI双染流式细胞术观察细胞在低氧无血清条件下的抗凋亡能力。结果：来源于糖尿病大鼠的骨髓间充质干细胞的增殖较正常的大鼠显著性减慢（P
【关键词】 糖尿病 间充质干细胞 VEGF 细胞凋亡 增殖 大鼠
Abstract: Objective: To study the effect of diabetic inner environment on the biological properties of marrow mesenchymal stem cells derived from bone(BMSCs). Methods: BMSCs were harvested from the normal and diabetic rats induced by streptozotocin (STZ). Cell proliferation was evaluated using cell counting kit-8 (CCK-8) assay. The secretory volume of vascular endothelial growth factor (VEGF) and insulin-like growth factor (IGF-1) were measured by enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) and the anti-apoptosis capacity of the cell under the hypoxia and serum deprivation (hypoxia/SD) was detected by Hoechst33342 staining and annexin V/PI dual-color flow cytometry. Results: BMSCs from the diabetic rats induced by STZ could be successfully harvested and expanded in vitro. However they showed more spread-out and flattened appearance and larger size. The proliferative ability of diabetic rats derived from BMSCs were significantly decreased compared with the normal rats (P
Key words: diabetes；mesenchymal stem cells；vascular endothelial growth factor；apoptosis；proliferation；rats
干细胞治疗心肌梗死已被证实是一种较有前景的治疗方法。骨髓间充质干细胞（bone mar-row mesenchymal stem cells，BMSCs）由于具有取材容易、体外增殖能力强、低免疫原性、可分化为不同类型的成熟细胞等优点[1-2]，成为最佳的移植细胞来源。但是和其他体细胞类似，BMSCs也易受各种因素如：年龄、氧化应激和高糖[3-4]等的影响而导致其生物学性状改变。
糖尿病患者复杂的体内环境，包括长期的高血糖、高血脂、酮体的增多、活性氧等，势必会对自身体内的BMSCs产生影响[5-6]。目前国内外在干细胞治疗心梗的研究中，大多采用正常或者年轻的BMSCs作为移植细胞来源。为了确定糖尿病体内环境对BMSCs的影响以及其能否作为自体移植的细胞来源，我们将以糖尿病大鼠来源的BMSCs作为研究对象，在体外培养条件下进行一系列的生物学特性检测，就此问题进行初步探讨。
1 材料和方法
1.1 动物
220 g Spraque Dawley(SD)大鼠由温州医学院实验动物中心提供，所有研究都经温州医学院实验动物委员会批准。
1.2 主要试剂
DMEM、胰蛋白酶、胎牛血清购自Gibco公司；链脲佐菌素（STZ）、Hoechst 33342购自Sigma公司；细胞低氧培养盒、缺氧催化剂购自BioM6rieux-sa(France)；膜联蛋白 (annexin)-V FITC细胞凋亡检测试剂盒购自北京宝赛生物公司；酶联免疫吸附试验（ELISA）试剂盒购自R&D公司。
1.3 糖尿病大鼠模型的制备
12只健康的SD大鼠随机平均分为两组，分别为糖尿病组和正常对照组。两组大鼠在禁食12 h后分别予单次腹腔注射STZ柠檬酸缓冲液(55 mg/kg)和柠檬酸缓冲液。3 d后剪尾静脉测血糖，以>16.67 mmol/L视为糖尿病模型成功，腹腔注射后3周复测1次尾静脉血糖和体重，以确保血糖浓度>16.67 mmol/L。糖尿病模型合格的和正常对照组大鼠继续饲养10周，为下面实验做准备。
1.4 骨髓间充质干细胞的分离和培养
无菌条件下分别剥离糖尿病大鼠和正常对照大鼠的股骨和胫骨[3]，以全骨髓贴壁法分离并培养BMSCs，待状态良好的第二代细胞生长达到70%～80%汇合时可用于以下实验。
1.5 细胞增殖能力检测
取生长良好的第二代骨髓间充质干细胞，于96孔板的每个孔中加入100μL细胞悬液，细胞数为1.5×103，培养基每2天更换一次。于细胞接种后的7 d内，每天取5个孔进行检测，每个孔内加入CCK-8试剂10μL，置培养箱内孵育4 h后，用全自动酶标仪检测490 nm（参比波长630 nm）的吸光度值（OD值），取平均值，以培养时间为横坐标，以相应的OD值为纵坐标，描绘生长曲线。
1.6 间充质干细胞凋亡的检测
1.6.1 细胞模拟缺血处理(无血清和低氧联合处理)：当第二代细胞生长达到70%～80%汇合时用PBS冲洗2次，加入不含胎牛血清的DMEM培养基，然后迅速将细胞放入密闭低氧罐中，置于37 ℃、5% CO2 细胞培养箱内培养6 h。
1.6.2 形态学检测：将进行低氧和无血清处理后的细胞用PBS洗1次，然后加入含Hoechst33342的无血清DMEM培养基，Hoechst33342终浓度为0.1 mg/mL，室温避光反应10 min。用荧光显微镜观察，紫外光激发，观察凋亡细胞并摄片。
1.6.3 流式检测：取经低氧无血清处理的7×105个细胞，用0.125%胰蛋白酶/0.04% EDTA消化细胞后，4 ℃，以800 r/min离心4 min后，弃掉上清液；细胞用PBS冲洗1次后悬浮于200μL结合缓冲液。然后加入10μL 20μg/mL的异硫氰酸荧光素(FITC)标记的膜联蛋白V(膜联蛋白-V-FITC)，轻轻混匀后，4 ℃避光反应15 min。加入5μL 50μg/mL的PI，300μL结合缓冲液，轻轻混匀，用流式细胞仪检测活细胞、早期和中晚期凋亡细胞及坏死细胞所占的比例。
1.7 血管内皮生长因子（VEGF）和胰岛素生长因子-1（IGF-1）的ELISA检测
将生长良好的第二代骨髓间充质干细胞用PBS冲洗1次后，添加不含血清DMEM培养基置于37 ℃、5% CO2细胞培养箱内培养6 h后，取上清液备用。按照ELISA试剂盒操作说明书，用双抗体夹心法分别检测细胞培养上清中VEGF和IGF-1的含量，每份标本设3个复孔。用全自动酶标仪测450 nm处吸光度值，取其平均值，根据所绘制的标准曲线计算出各个细胞因子的含量。
1.8 统计学处理方法
采用独立样本t检验。
2 结果
2.1 大鼠BMSCs的培养和增殖能力检测
采用常规细胞原代培养法，成功培养了糖尿病大鼠的BMSCs。相差显微镜下对细胞形态进行了观察，如图1A所示培养的原代细胞呈长梭型，集落生长，中间较密，夹杂着圆形高亮未贴壁的杂细胞，但是糖尿病大鼠的BMSCs所形成的集落较正常大鼠的明显要小，而且贴壁后4~5 d才表现出成纤维样生长特性。细胞传代后，在第1代和第2代细胞生长呈现明显的漩涡状，但是相对于正常大鼠BMSCs饱满的细胞形态，糖尿病大鼠的则表现为细胞伸展无力，且较为扁平。本实验所用细胞均为第2代BMSCs。利用CCK-8检测的结果显示(见图1B)，糖尿病来源的骨髓间充质干细胞增殖能力明显较正常来源的低（P
2.2 VEGF和IGF-1的分泌量
ELISA结果（见图2）显示糖尿病大鼠来源BMSCs的VEGF和IGF-1的分泌量较正常来源的明显降低(分别为P
2.3 细胞凋亡
在缺血无血清联合处理后(图3A)，相差显微镜照片可以显示明显的细胞凋亡表征，即胞核皱缩变圆，贴壁细胞数量明显地减少。Hoechst33342染色后，正常细胞核呈弥散均匀的荧光， 而凋亡的细胞， 细胞核与细胞质中可见浓染致密的颗粒荧光， 被认为是典型的凋亡细胞。
2.4 膜联蛋白V/PI双染流式细胞术检测细胞凋亡膜联蛋白
糖尿病来源的BMSCs中早期凋亡细胞(膜联蛋白为V+/PI-）较正常大鼠来源的明显增多（P 0.05）。
3 讨论
随着冠心病发病机制研究的深入，更多的证据表明，作为代谢综合征之一的糖尿病和冠心病的发生有着密切的关系[5]。而糖尿病患者体内的高糖、酮体、氧化产物等有害物质的增多，势必对自体来源的BMSCs的性状产生影响。在本研究中我们通过利用STZ诱导糖尿病大鼠模型，在经体外培养后发现，糖尿病来源的BMSCs在增殖能力上明显减弱，并且在细胞的分泌和抗凋亡能力上也较正常大鼠来源的显著降低。
在BMSCs治疗心肌梗死的研究中，首先要在体外扩增得到移植所需的细胞量。我们在研究中发现，在原代培养中糖尿病来源细胞在贴壁后4～5 d才表现出成纤维样生长的特性，且糖尿病来源的BMSCs的增殖能力明显降低，并且细胞较为扁平。原代体外贴壁时间的延长和细胞形态的变化说明其对环境的适应能力降低，需要较长的时间来恢复其生长增殖能力。另外有研究表明，传代后细胞变为扁平，具有这样的形态特征为细胞衰老的表象[7]，并且与我们所得出的增殖能力的下降是相一致的。
另外在BMSCs移植提高梗死后的心功能上，干细胞所分泌的细胞因子被认为是提高心功能的主要因素之一[8]，其中VEGF和IGF-1在促进新生血管的生成和细胞增殖方面起着非常重要的作用。我们的研究表明，糖尿病来源的BMSCs其VEGF和IGF-1分泌量较正常来源的明显降低。Liu等[9]利用高糖培养多功能前体细胞后，VEGF的分泌量也可以得到类似的结果，但是其细胞来源为正常的幼年大鼠。在本实验中所采用的干细胞培养条件为正常的培养条件，说明糖尿病的体内环境对糖尿病来源的干细胞其分泌能力有不可逆的损害作用。另据研究表明，VEGF和IGF-1在糖尿病患者的肾脏和视网膜以及血液中的浓度明显高于正常水平[10]，但是糖尿病自身来源的BMSCs所分泌的VEGF和IGF-1较正常的明显降低，造成这种矛盾的结果，可能是不同的组织来源的细胞对于糖尿病内环境的反应性不同，并且VEGF和IGF-1在糖尿病肾病和视网膜病变等糖尿病并发症的发展中起着重要的作用。至于细胞移植后分泌的细胞因子，是否会加速糖尿病并发症的发展进程，需要更深入地研究。
影响干细胞治疗心梗疗效的另一重要因素是在干细胞移植后细胞在心梗区的存活率较低，而心肌梗死区缺血低氧的环境是导致细胞凋亡的主要原因。我们采用体外低氧无血清的方法建立细胞凋亡模型[11]，发现糖尿病组的抗凋亡能力明显较正常组下降。现有的体外研究表明，体外的高糖、丙酮醛类、活性氧产物（ROS）等环境对细胞的凋亡起着很大的促进作用，而这些因素在糖尿病患者中均存在。另外，VEGF的分泌减少和糖尿病BMSCs在体外培养条件下的所表现出细胞衰老的形态学特征，抗细胞凋亡能力的下降也起着重要的促进作用。
目前关于糖尿病大鼠来源的BMSCs在增殖、分泌和抗凋亡能力下降方面的确切机制目前尚不清楚，可能与糖尿病体内复杂的病理生理条件造成干细胞的线粒体功能障碍[12]、高糖所导致的细胞复制性衰老[3]和相应的信号通道阻断等有关[9]。在本实验中，我们选择均为同龄的大鼠作为实验对象，避免了因年龄不同而造成的误差；在细胞培养方面，均在体外正常的培养条件下进行，从而可以得出糖尿病对BMSCs的各种生物学性状的损害是客观存在的。
本研究也存在若干不足，如没有将培养得到的糖尿病BMSCs移植回动物心梗模型体内，检测其对心功能的改善情况。另外，在糖尿病来源的BMSCs在抗凋亡能力、增殖能力和分泌能力损伤的机制上，没有做进一步的探讨，这也是我们下一步实验的方向。
参考文献
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[10] Duh E， Aiello Lp. Vascular endothelial growth factor and diabetes: the agonist versus antagonist paradox[J]. Diabetes，1999，48(10):1899-1906.
放免法检测胰岛素分泌量。结果: 在大鼠β细胞素浓度为20～30 mg/L时, 大鼠胰腺干细胞转分化为胰岛样细胞团的数量明显高于对照组; 其胰岛素分泌量明显高于对照组(P<0.01)。结论: 大鼠β细胞素具有促进胰腺干细胞转分化为胰岛β细胞并增强其胰岛素分泌的作用。
关键词： β细胞素; 糖尿病 胰腺干细胞
胰岛移植是治疗糖尿病的一个热点, 但供体的缺乏和存在免疫排斥反应限制了其应用。胰腺干细胞能定向分化成胰岛细胞, 这为胰岛移植提供了新的材料来源［1］。细胞生长因子在干细胞的发育和分化中发挥了重要作用。研究表明, β细胞素（betacellulin, BTC）属于表皮细
胞生长因子家族中的一个成员, 具有多种生物学功能, 胰腺BTC mRNA的高水平表达, 提示BTC可能在胰腺组织的发育中发挥重要的生理作用［2, 3］。本研究中通过建立稳定的胰腺干细胞体外培养方法, 将β细胞素用于胰腺干细胞的体外培养, 观察其是否能促进胰腺干细胞转分化为成熟的胰岛, 为克服胰岛移植时的供体短缺提供新的胰岛来源。
1 材料和方法
1.1 材料
SD大鼠（体质量250 g, 雌雄不限, 饲养于清洁级动物房自由饮水和进食, 手术前1 d禁饮食）由第四军医大学动物中心提供, Ⅴ型胶原酶、 Histopaque(1.119 kg/L)、Histopaque(1.098)(kg/L)、 Histopaque(1.077 kg/L)、 碱性成纤维细胞生长因子2(basic fibroblast growth factor 2, bFGF2)、 角朊细胞生长因子(keratinocyte growth factor, KGF)、 ITS(insulintransferin selenium)购自Sigma公司; 牛血清白蛋白(BSA) 购自杭州四季青生物制品公司; 双硫腙（dithizone, DTZ）、 二甲基亚砜（DMSO）、 烟碱购
于华美公司; 兔抗小鼠的PDX1和CK19抗体购自北京中山生物工程有限公司; 免疫组化SP检测试剂盒购自福州迈新生物技术开发有限公司; CMRL1066、 DMEM/F12 购于Gibco公司; 胰岛素放射免疫分析试剂盒购于北京北方生物技术研究所; 大鼠β细胞素由本研究室采用基因工程方法获得［4］。
1.2 方法
1.2.1 大鼠胰腺干细胞的分离、 培养
采用宋振顺等［5］的方法, 首先以Ⅴ型胶原酶消化成年SD大鼠胰腺组织, 然后采用非连续密度梯度离
心法纯化消化后的胰腺细胞, 去除胰岛细胞后, 收集外分泌部细胞进行培养。所获的细胞培养在含100 mL/L胎牛血清的CMRL1066培养液中, 其中添加100 U/mL青霉素、 100 g/L链霉素、 500 μg/L二性霉素B。第3天将培养液改为DMEM/F12, 其中加入ITS（5 mU/L胰岛素+5 mg/L转铁蛋白+5 mg/L硒）500 μg/L二性霉素B, 2 g/L牛血清白蛋白、 10 mmol /L烟碱, 0.01 ng/L KGF等。此后每2～3 d换液1次。于相差显微镜下观察细胞生长状况和克隆形成情况。
1.2.2 胰腺干细胞免疫组织化学染色
分别取培养3、 7、 14 d后的细胞爬片, 0.4 g/L多聚甲醛(PFA)固定后, PBS缓冲液冲洗玻片, 分别与兔抗小鼠PDX1、 CK19 抗体4℃反应过夜, 二抗及呈色反应参照SP试剂盒说明。二氨基联苯胺(DAB)显色, 显微镜观察, 自来水冲洗, 苏木精复染, 中性树胶封固。阴性对照用PBS代替一抗。
1.2.3 双硫腙染色与计数
双硫腙(DTZ)为螯合剂, 可与铅、 铜、 锌等螯合, 人和动物（豚鼠除外）的胰岛β细胞因含有锌, 双硫腙染色呈猩红色, 其他胰岛细胞不着色。配制及染色方法: 用二甲基亚砜（DMSO）配制: DTZ 10 mg溶于10 mL DMSO, 用Hanks（pH7.8）1∶100稀释, 0.22 μm滤膜过滤, DTZ与胰腺干细胞培养后转分化形成的克隆混合, 室温5～10 min后做镜检。按胰岛的直径>50 μm计数染色的胰岛样细胞团, <50 μm者不计。
1.2.4 胰岛素检测
胰腺干细胞转分化后形成的胰岛克隆对葡萄糖刺激有胰岛素分泌反应。显微镜下挑取100个胰岛样细胞团克隆, 培养于24孔培养板, 先用含低糖（5.5 mmol/L）的DMEM/F12培养液在37℃下孵育1 h后, 更换为含高糖（16.7 mmol/L）加烟碱（10 mmol/L）的DMEM/F12培养液在37℃下孵育2 h后, 取培养液上清, 采用放免法测定胰岛素含量。
1.2.5 实验分组
按照实验方法1.2.1中胰腺干细胞的培养方法培养大鼠胰腺干细胞, 并将其设为正常对照组, 各实验组中分别加入不同浓度的大鼠β细胞素, 依次为10、 20、 30、 40、 50 mg/L, 共设立5个实验组。
1.2.6 统计学处理
采用Student t检验方法, 应用SPSS10.0统计软件完成统计学分析。
2 结果
2.1 成人胰腺导管上皮细胞光镜下形态学变化
收获的非胰岛细胞于24～48 h内部分黏着于培养瓶底。在第1～3天换液时, 大量漂浮于培养液中的外分泌细胞和胰岛被弃除。培养5 d内, 单个贴壁细胞迅速扩增为鹅卵石样小细胞片进而分裂增殖成单层细胞。培养第3天改用无血清培养液及加入霍乱毒素, 可明显地促进导管上皮细胞的生长和抑制成纤维细胞的污染。细胞培养第7天胰岛样细胞芽团开始从细胞片或单层细胞的中央或边缘出现, 同时鹅卵石样细胞片迅速扩大。此后大量胰岛样细胞芽团和囊状细胞团出现。双硫腙染色呈弱阳性。第21～27天, 大量较成熟的胰岛样结构出现,双硫腙染色强阳性（图1）。
关键词：桦木酸；石见穿；人肝癌HepG2细胞；肿瘤干细胞；细胞凋亡
DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2017.02.016
中图分类号：R285.5 文献标识码：A 文章编号：1005-5304（2017）02-0060-05
肝细胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）是紧随肺癌、胃癌、食管癌之后的发病率和死亡率较高的恶性肿瘤。最新数据显示，肝癌在60岁以下的男性中属发病率最高和死亡率最高的癌症[1]。由于肝癌的高复发、高转移率和化疗抗药性，治疗效果并不乐观。近年来，越来越多的学者认为彻底治愈肿瘤的有效疗
法除针对肿瘤组织中的大部分肿瘤细胞，更重要的是靶向其中的肿瘤干细胞[2-3]。肿瘤干细胞（cancer stem cell，CSC）是肿瘤组织中存在的极小部分细胞，通常处于静止状态，当受到细胞因子等影响时会导致肿瘤的发生、转移和复发，这均源于CSC拥有很强的自我更新及增殖分化的能力。我们前期以S180荷瘤小鼠、H22荷瘤小鼠为模型进行体内筛选，发现中药石见穿具有较好的抗肿瘤作用[4-5]，进一步对石见穿进行化学成分分析，发现桦木酸（betulinic acid，BA）为石见穿发挥抗肿瘤作用的主要有效成分之一。因此，本实验观察BA对人肝癌HepG2肿瘤干细胞增殖的影响，并从细胞生长周期和细胞凋亡两方面初步探讨其抗肝癌的作用机制。
1 实验材料
1.1 细胞株
人肝癌HepG2细胞株，中国科学院细胞库，目录号TCHu72。
1.2 主要试剂与仪器
BA（Sigma），5-氟尿嘧啶（5-FU，海普药业），胎牛血清（Gibco），DMEM/F12+GlutaMAX-I培B基（Gibco），肝素（Sigma），B27神经细胞生长添加剂（Gibco），碱性成纤维细胞生长因子（bFGF，Acro Biosystem），成纤维细胞生长因子（EGF，Acro Biosystem），BSA（Sigma），青链霉素混合液（Solarbio），磷酸盐缓冲液（HyClone），0.25%胰蛋白酶、DMSO（MP Biomedicals），无酚红DMEM（Macgene），CCK-8试剂盒（Dojindo），细胞周期试剂盒（上海碧云天生物技术有限公司），FITC Annexin V凋亡试剂盒（BD）。MCO175型CO2培养箱（德国Galaxy公司），TH-200型显微镜（日本Olympus公司），Stnergy-4型酶标仪（美国Biotek公司），IEC-CL31R型离心机（美国Thermo Fisher公司），NAVISO型流式细胞仪（美国Bechman Coulter公司），JCSO344型高压蒸汽灭菌锅（日本Hirayama公司）。
2 实验方法
2.1 人肝癌HepG2肿瘤干细胞培养
参考文献[6-7]进行无血清培养基的制备及人肝癌HepG2肿瘤球干细胞的培养和传代。
2.1.1 无血清干细胞培养基制备 在DMEM/F12培养基中添加20 ng/mL EGF、10 ng/mL bFGF、2% B27、4 μg/mL肝素、0.4%BSA、100 U/mL青霉素和100 μg/mL链霉素。
2.1.2 细胞培养 正常培养人肝癌HepG2细胞，胰酶消化无血清培养基重悬，计数，稀释为2×103/mL，2.5 mL/孔，则5×103/孔接种于低吸附6孔板。置于37 ℃、5%CO2培养箱中培养。1 d后可观察到有悬浮细胞球形成。每3 d半量换液。
2.1.3 细胞传代 当细胞形成悬浮细胞球（约6 d），进行传代培养。将含细胞培养液悬浮细胞收集于离心管中，800 r/min离心5 min，1 mL胰酶替代物TrypLE Express消化，加胰酶时吹打几下稍等片刻，即可加PBS稀释，离心洗涤2～3次后无血清培养基重悬，再取适量加无血清培养基稀释培养。
2.2 分组和给药
正常组：DMEM培养基；对照组：DMEM培养基（含0.01%DMSO）；5-FU组：10 μg/mL 5-FU；BA各剂量组：DMSO为溶剂制备40 mmol/L BA，实验过程中以1000倍培养液稀释为40 μmol/L，同时等比对倍稀释分别得到浓度为20、10、5、2.5、1.25 μmol/L的BA培养液。
2.3 细胞自我更新能力验证
收集肿瘤干细胞，无血清培养基稀释为每毫升500个。在低吸附96孔板上每孔加入150 μL无血清培养基，并将稀释好的肿瘤干细胞2 μL/孔加入96孔板。镜下观察，选取有且仅有1个细胞的孔每日拍照记录。
2.4 细胞增殖检测
将对数生长期的人肝癌HepG2肿瘤干细胞制成1×108/L的细胞悬液，接种于低吸附96孔板，于37 ℃、5%CO2培养箱中培养，24 h后更换不含细胞因子的DMEM/F12培养基同步化使细胞处于G0期，24 h后分组处理，分别培养于BA浓度为40、20、10、5 μmol/L的无血清培养基中，每组设5个复孔，继续培养。48 h后弃上清液，PBS冲洗1遍后每孔加入配制好的CCK-8试剂120 μL，培养箱中继续孵育2 h。将显色完成的液体转移至正常96孔板中，于酶标仪波长490 nm处检测吸光度（OD）值。计算细胞抑制率。细胞抑制率（%）=（对照孔OD值-给药孔OD值）÷对照孔OD值×100%。
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【关键词】 人胚胎肺;间充质干细胞; 放射性肺炎
放射性肺损伤是最为常见和严重的胸部放疗并发症之一，其高发病率限制了肿瘤的放疗剂量，从而使肿瘤治疗疗效下降，部分重度放射性肺损伤明显增加了患者的死亡风险。因此积极寻找能够预防、逆转和治疗放射性肺损伤并且副作用小的治疗方法成为非常重要的课题。人们在许多组织和器官中都发现和分离了具有多分化潜能的相应干细胞，但在肺组织证实和分离肺干细胞的研究进展缓慢，呼吸道黏膜上皮及肺泡上皮细胞终生不断自我更新，尤其在肺组织严重损伤以后，上皮更新，促进创伤修复，在理论上肯定存在多能干细胞，人们用同位素标记的方法取得了一些肺干细胞存在的证据，肺泡上皮Ⅱ型细胞中可能存在具有干细胞特征的细胞类型。本研究通过对人胚肺MSC分离、传代培养、生物学特性及多向分化能力的测定，明确了人胚肺MSC的干细胞特性。通过动物体内实验及体外细胞培养试验，证实了人胚肺MSC能有效促进肺泡上皮细胞的生长，且能对放射性损伤后肺上皮细胞进行修复〔1，2〕。
1 材料与方法
1.1 MSC的分离和培养 选取15例水囊引产胎儿，胎龄为3～5个月。取胎儿肺脏，用DHanks液反复冲洗，剪成碎块，用0.2% Ⅱ型胶原酶(Sigma)消化，37℃、30 min，过100目钢网，制成单细胞悬液，细胞密度为2×106/ml，用含DMEM/F12，MCDB201，2% FCS(Gibco BRL公司)培养液，置37℃，5% CO2培养箱培养，3 d后换液，弃去非贴壁的细胞，以后每3天半量换液。当细胞达80%～90%融合时，0.25%胰酶(Sigma)常规消化传代。
1.2 细胞形态学观察及细胞周期的测定
1.2.1 细胞形态学观察 取1～7代MSC，置于有小玻片的3.5cm直径平皿中，37℃，饱和湿度，5% CO2培养12 d后取出，空气风干，瑞士染色，油镜下观察细胞形态。
1.2.2 细胞周期的测定 MSC细胞周期分析的主要试剂：RNA酶I(TaKaRa)，碘化丙啶(PI，Sigma)。将胎儿MSC消化，70%冷乙醇4℃固定30 min，PBS液洗涤细胞2遍，5 μg/ml I染色(室温，5 min)，用流式细胞仪(FACSVantage型)检测，Mod FIT软件分析结果。用流式细胞仪测定第11、15代MSC的DNA含量，可见处于G0/G1期的细胞多，分别为95.34%、95.68%，S期少，分别为4.13%、3.58%。
1.3 免疫组化及PTPCR方法检测人胚肺MSC向成骨细胞及脂肪细胞诱导分化能力
1.3.1 人胚肺MSC的一般生物学特性 单个核细胞培养48～72 h后，在镜下可见散在的贴壁细胞，呈典型纺锤样成纤维细胞状，7～10 d形成放射状克隆，挑出20个克隆分别培养，约1 w形成致密的贴壁细胞层，细胞形态均一，生长速度快，易被胰酶消化，可传至17代以上，其形态及生长特点不发生明显改变。以下描述中将此类细胞称为人胚肺贴壁细胞(fetal lungderived adherent cell，FLAC)，见图1。
1.3.2 MSC多系诱导分化的鉴定 FLAC在成脂肪诱导体系中培养3 d，细胞由成纤维细胞样逐渐收缩变短，成为立方形或多角形。连续培养7 d，镜下可见细胞内有微小脂滴出现，随着时间的延长，脂滴逐渐增大融合。培养2 w时，可见融合成团的脂滴充满整个细胞，诱导2周期后用油红O染色，可见细胞内产生的脂肪被特异的染成红色，见图2B。上述细胞同时表达脂肪细胞特异性的PPARγ2。成骨培养中细胞形态由原来的梭形变成了立方形，随着细胞生长密度的增长形成多层的结节结构，而对照中细胞仍是梭形且呈单层生长;80%～90%的细胞呈Apase阳性，而对照中的Apase阳性细胞较少;von Kossa染色发现在成骨培养有明显的钙化基质沉积，而对照中未见到此现象;RTPCR分析表明MSC经OS诱导分化培养后表达骨钙蛋白基因，见图2C。
1.4 放射性肺炎肺泡上皮细胞的培养 2BS细胞条件培养液的获取：(1)条件培养基1的制备：2BS细胞培养至当细胞生长融合达90%时，给予换液，24 h后无菌条件下取其上清，过滤细胞碎片后备用。(2)条件培养基2的制备：2BS细胞培养至当细胞生长融合达90%时，给予换液，同时取C57BL/6小鼠全肺用6MVX线直线加速器进行单次照射13 Gy后单个肺细胞进行共培养，24 h后取上清，过滤细胞碎片后备用。
1.5 细胞培养技术体外测定人胚肺MSC修复放射损伤肺组织的能力，对比检测实验及对照组TGFβ1的含量
1.5.1 实验动物和饲养环境 健康雌性 C57BL/6 小鼠40只，体重(200±20)g，由上海实验动物研究中心提供，饲养于SPF级大鼠饲养室，受试前笼养7 d以适应环境。
1.5.2 试剂及仪器 大鼠转化生长因子β1(TGFβ1)ELISA试剂盒，为博士德公司产品。SIEMENS PRIMUS KP2型直线加速器由德国西门子公司生产。
1.5.3 动物分组 在照射前1 w将40只雌性，C57BL/6 小鼠，随机分作随机分为空白组、模型组、实验组1，实验组2，每组动物均为10只。
1.5.4 模型建立及实验方法 空白组：不做任何处理;其余3组均用6MVX线直线加速器进行全肺单次照射13 Gy;实验组1照射后每3日给予尾静脉注射条件培养液1约0.3 ml;实验组2照射后每3日给予尾静脉注射条件培养液2约0.3 ml。
1.5.5 标本收集及处理 照射后4 w，每组各随机取5只小鼠活体取材。腹腔注射2%戊巴比妥钠0.12 ml/100 g，将大鼠麻醉后，分别取4 ml腹主动脉血用ELISA方法检测血清中TGFβ1的水平;将右上肺组织固定于10%缓冲性甲醛液中，常规制成石蜡切片备用，HE染色后光镜观察病理改变。
2 结 果
2.1 光镜下观察组织病理改变 与空白组小鼠比较，模型组小鼠的肺组织照射后存在明显的病理组织学改变，早期以急性炎症反应为主，表现为肺充血、水肿、肺间质增厚，见图3A;实验组1的病理与单纯照射组小鼠相似，存在明显的炎症反应，肺充血、水肿明显，且肺泡腔内可见明显渗出液，提示炎症反应较重，见图3B。实验组2的病理表现则与正常组小鼠接近，炎症反应较轻，仅表现为轻度肺充血，见图3C。
2.2 照射后各组大鼠血清TGFβ1水平 照射后4 w开始，实验组1及模型组小鼠血清TGFβ1浓度明显增高〔(30.25±6.33) ng/ml vs (16.95±2.47) ng/ml〕，实验组1尤为明显(P
3 讨 论
现阶段研究表明，放射性肺炎所致的肺组织损伤不仅仅是单一靶细胞损伤的结果，而且是一个有多种细胞参与、有多种细胞因子调控的复杂过程〔3〕。放射线致使肺泡Ⅱ型细胞和血管内皮细胞受损〔4〕，急性期表现为肺血管特别是毛细血管损伤，产生充血、水肿和细胞浸润，急性改变有可能自行消散，但常引起肺结缔组织增生和纤维化。其中肺组织病理改变是反映肺炎程度的最直观指标，可判断肺炎的程度，同时也可以筛选预防与治疗的药物。基础研究发现，放射性肺损伤可引起肺内效应细胞即肺泡巨噬细胞、成纤维细胞和血管内皮细胞释放多种细胞因子，介导炎性反应，启动和促进肺组织纤维化。其中TGFβ1较为重要，是诸多参与放射性肺损伤因子中颇受关注的细胞因子，能够将生物效应扩大，参与放射性肺损伤的发生与发展〔4〕。
近年来，干细胞的研究引起了人们的极大关注，而成体干细胞的可塑性研究是干细胞研究领域的热点之一，其中发现最早并且研究最多的是骨髓间充质干细胞(BMSCs)。BMSCs是来源于中胚层的一类多能干细胞，在不同诱导条件下具有向心肌细胞、肝细胞、神经元及肺泡上皮细胞等分化的多项潜能〔5～7〕。BMSCs可取自自体骨髓，取材方便且体外易于分离培养，对机体损伤小，免疫原性弱，组织相容性好，这为移植BMSCs替代治疗受损组织提供了可能。
放射性肺炎与多种细胞、生长因子的激活和相互作用有关。有文献报道〔8〕，小鼠肺部接受照射后1 d，肺组织中即可出现TGFβ基因和Ⅰ型胶原基因的表达增多;照射后14 d，其表达量为第1天的5倍。研究表明，发生放射性肺损伤患者的血清TGFβ1含量也持续升高〔9〕，提示血清TGFβ1可作为放射性肺损伤的预测因子，并且可通过降低血清TGFβ1浓度来减轻肺组织的损伤。本实验显示，在照射后初期，小鼠血清TGFβ1浓度就显著增高，而人胚肺MSC却能使血清TGFβ1浓度持续下降，起到减轻放射性肺炎的作用。本研究发现放射性肺炎是在各种靶细胞和TGFβ1等细胞因子的共同作用下相互影响、相互调节的。人胚肺MSC可能通过下调TGFβ1的表达对急性放射性肺炎起到一定的防治作用，可为临床提供有关放射性肺炎治疗的新的生物治疗方法。
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【摘要】 目的 综述近年来骨髓间充质干细胞体外培养、定向分化为成骨细胞的条件及相关研究进展。方法 查阅大量相关文献，整理、综合、分析骨髓间充质干细胞的研究进展。结果 骨髓间充质干细胞具有增殖和分化潜能，在特定条件下可定向分化为成骨细胞，目前倾向于多因素联合应用或序贯使用促进骨髓间充质细胞高效表达成骨标志产物，提高成骨率。结论 骨髓间充质干细胞可满足骨组织工程中种子细胞的要求，具有广阔的发展前景和临床应用价值。
关键词 组织工程 骨髓间充质干细胞 成骨
骨组织工程学研究内容包括种子细胞、载体、诱导物质以及组织工程化骨组织的临床应用等诸多方面，其中种子细胞是组织工程研究中首要的、最基本的环节。20世纪70年代中期 ［1］ 就已证实骨髓间充质干细胞（Bone marrow mesˉenchymal stem cells，BMMSCs）具有自我增殖能力和分化潜能，而且BMMSCs具有来源广泛、取材简单、分化成骨潜能强等特点，成为目前骨组
织工程种子细胞研究的重点。
1 骨髓间充质干细胞体外培养研究进展
干细胞是指那些具有高度增殖和自我更新能力，并能分化为两种以上不同类型组织细胞的细胞;组织干细胞是指发育成熟的个体内具有多向分化潜能的细胞，目前比较明确的能够转化的组织干细胞主要是骨髓间充质干细胞（Bone marrow mesenchymal stem cells，BMMSCs）。Freidenˉstein ［1］ 发现了骨髓培养中有呈纺锤状的少量贴壁细胞，能够分化形成多种中胚层组织，包括:骨、软骨、肌腱、肌肉组织、骨髓基质结缔组织等，这种形成集落的初始骨髓基质细胞被称为成纤维细胞样细胞集落形成单位（Colony forming unit-firbroblastic，CFU-F）。Mingnell ［2］ 认为BMMSCs为存在于骨髓基质中的非造血来源的细胞亚群，Ashton ［3］ 称其为骨髓基质成纤维细胞。BMMSCs对营养条件要求高，而且含量很低，约为0.001%～0.01%，要利用BMMSCs就必需实现其体外分离培养及扩增 ［4］ 。BMMSCs培养方法主要有全骨髓培养法和离心培养法，前者是将无菌抽取的骨髓加入培养液制成细胞悬液，原代培养培养物以造血细胞成分居多，为利于BMMSCs的贴壁生长，可采用DMEN和胎牛血清。胎牛血清终浓度为10%～20%，塑料培养瓶较一般玻璃培养瓶更有利于BMMSCs贴壁生长。有人主张用4%醋酸溶解RBC，去除RBC对BMMSCs的贴壁干扰，但有人认为RBC会随着换液而逐渐被自然去除，对BMMSCs影响不大。细胞融合后以1:2比例传代，3～4天换液一次 ［5］ 。离心培养法是根据骨髓中细胞成分比重的不同，采用离心分离法提取单核细胞进行培养。在新鲜无菌的骨髓抽取物中加入抗凝培养液稀释，以1500～2000r/min离心20～30min，采集交界处的单核细胞层，PBS洗涤2～3次后，加入培养液接种培养。机体内BMMSC数量很少，接种数目太少会影响成骨率，太多对于临床应用又不太现实，每立方厘米载体接种1×10 6 个细胞就能满足成骨要求。
目前，三维细胞培养技术已在骨组织工程中得到广泛应用，Kinoshita ［6］ 等利用胶原凝胶载体培养BMMSCs，发现三维的胶原网络能有效的刺激成骨细胞分化;Glowacki ［7］ 等采用培养液灌注造成动力性三维细胞培养环境，增加了细胞的适应生存能力及成骨功能。三维细胞培养能够有效地种植功能细胞、保持旺盛的细胞活性、最大程度地发挥细胞的功能。特别是流体力学刺激可通过PGE 2 途径将力学刺激转导至细胞内发挥调节作用，能够明显增加成骨细胞增殖，总蛋白合成和DNA合成增加 ［8］ 。
2 骨髓间充质干细胞定向分化的研究进展
特定条件下，组织干细胞才能向成骨细胞转化，骨髓间充质干细胞成骨很大程度上依赖于体外培养条件，而且，BMMSCs的定向分化还受到其他多种条件的制约和影响。体外细胞的分化程度决定着成骨的成败，加入成骨诱导剂可促使BMMSCs向成骨细胞分化。化学物质（如Dex、1，25（OH） 2 D 3 、β-GP、维生素C等），细胞因子（如BMP、TGF-β、bFGF等）可促进BMMSCs成骨过程中标志产物ALP、BGP、骨桥蛋白、骨涎蛋白等高效表达及矿化结节形成，提高成骨率。迄今为止，对这些诱导物的作用机制知之甚少，而且不同诱导剂的作用又不尽相同 ［9～11］ 。
大量实验研究发现:Dex作用于BMMSCs后，骨髓间充质干细胞ALP活性增强，骨钙素（BGP）、骨涎蛋白、骨桥蛋白的合成明显增加。Dex可促进BMMSCs的成骨分化，早期以促进基质合成为主，后期以促进矿化为主。Dex促进成骨的同时，亦诱导细胞向脂肪分化。Beresford ［10］ 在传代培养细胞中加入1，25（OH） 2 D 3 ，则抑制其向脂肪细胞转化，骨钙蛋白mRNA表达增加，证实向成骨细胞转化占优势，而仅在传代培养细胞中加入Dex时，则多向脂肪细胞转化，这主要是因为Dex促进成骨的同时，能激活BMMSCs表面的糖皮质激素受体，而1，25（OH） 2 D 3 通过降低脂肪细胞晚期基因标志物ap2和脂肪的mRNA水平而抑制糖皮质激素诱导的脂肪形成 ［11］ 。β-GP可释放磷酸根，为细胞矿化提供离子环境，可加速矿化结节的形成和骨钙素的合成。维生素C通过延长Ⅰ型胶原转录因子的半衰期而最终增加Ⅰ型胶原mRNA的含量 ［9］ 。
BMP、TGF-β、bFGF等细胞因子在骨髓间充质干细胞分化增殖中起着重要作用，但作用不一 ［12～14］ 。BMP为特异性的骨生长因子，靶细胞为血管周围具有分化能力的间充质细胞，能够启动BMMSCs的成骨过程，其作用机制:促进BMMSCs分化为成骨细胞，引导成骨细胞成骨表型的表达。BMP为唯一具有异位成骨能力的生长因子，可诱导诱导性骨祖细胞（Inducible osteogenic precursor cell，IOPC）向定向性骨祖细胞（Detenined osteogenic precursor cell，DOPC）分化，这一特征为骨组织工程的临床应用提供了广阔前景。TGF-β是较强的促成骨分化因子，在体内能够增强BMP的诱导成骨作用。TGF-β主要是通过促间充质干细胞分裂增殖，为BMP提供丰富的靶细胞;抑制脂肪细胞生成;促进骨细胞产生Ⅰ型胶原，抑制软骨细胞产生Ⅱ型胶原，增强基质钙化及对周围的成骨细胞的趋化作用，三方面提高BMMSCs的成骨效应。bFGF是一种促进血管生成剂，在骨移植时可促进局部毛细血管生长。bFGF能够促进BMMSCs体外培养CFU-F的形成，促进细胞增殖。bFGF可促进BMMSCs增殖的同时抑制其向成骨细胞分化;bFGF对Ⅱ型胶原蛋白的合成有促进增殖作用，而对于Ⅰ型胶原的影响比较复杂，可能bFGF是通过与细胞膜上bFGF受体结合及一系列信号转导最终激活DNA-结合蛋白，作用于靶细胞上特异的bFGF反应元件起作用。Kypreos ［14］ 报道bFGF抑制Ⅰ型胶原基因转导可能是由B-myb一种DNA-结合蛋白介导的，bFGF为具有负性调控作用的细胞因子。Marˉtin ［15］研究表明:bFGF对BMMSCs具有最强的促分裂作用，与BMP-2联合应用促BMMSCs转化作用强于应用单一细胞因子。骨的生长代谢是由多种细胞因子、化学物质、物理、生物因素等同时参与调节的过程，目前倾向于多因素联合应用或序贯使用。
随着多种骨生长因子调控基因分离成功及成骨机制的分子水平研究的不断深入，基因转移技术广泛用于骨组织工程领域，通过导入标志基因或治疗性基因，可致外源性调节基因表达于修复区，实现诱导成骨、免疫调节或成骨调控等预定目的。经BMP、TGF-β、潜在性膜蛋白（LMP-1）转染的BMMSCs已成功应用于骨组织工程化骨组织的构建和骨缺损的修复 ［16］。
3 问题及展望
近年来关于BMMSCs的研究有了较大发展，但将BMMˉSCs应用于临床，仍面临许多问题:（1）BMMSCs体外定向分化培养尚未探索出成熟的方法，分离纯化细胞群的技术有待进一步提高;（2）BMMSCs实验仅限于自体移植方面，在异体移植免疫反应问题上有待进一步探索;（3）如何促进BMMSCs与载体材料相容生长并成骨的难题有待进一步解决。随着三维细胞培养移植模型的进一步发展、基因转染技术的完善和生物可降解材料的日趋成熟，BMMSCs移植将有更广阔的前景，骨缺损、骨不连的治疗将进入一个工程化修复重建的崭新领域。
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【关键词】 心肌细胞 ;抑瘤活性 ;生物分化诱导
近年来，各国学者对鼠源性心肌细胞的生物活性研究很多，尤其是在医学上，鼠源性心肌细胞的生物活性物质有着很好的应用前景，为人类征服疾病带来曙光。目前最热门的研究就是心肌细胞的抑瘤活性物质和生物分化诱导功能，具有很大的研究价值和展望。现就目前对鼠源性心肌细胞的生物活性物质研究概括综述如下。
1 心肌细胞抑瘤活性物质的研究
据统计目前现有抗癌药物65%来自天然产物或其衍生物，它们在恶性肿瘤的临床治疗中具有极其重要的作用。在生物界中许多生物体内存在着大量天然抑瘤物，随着科学技术的飞速发展，越来越多的天然抑瘤物被人类所发现认识，不断地有新的天然抑瘤物被分离和鉴定出来。其中部分天然抑瘤物已经广泛地应用于恶性肿瘤的预防和临床治疗中，取得了可喜的经济效益和社会效益。而最让人值得期待的是从心肌细胞中分离和提纯更新的无毒副作用的低分子抑瘤物。吴敬波等学者[1]在心肌细胞培养液对鼻咽癌细胞生长的体外实验中得出结论：新生大鼠心肌细胞培养液可以选择性的抑制鼻咽癌细胞的增殖，心肌微环境中可能存在某种抑瘤物质，这可能是心肌转移瘤罕见性的主要机制。吴敬波、文庆莲等学者[2]在心肌细胞条件培养液对S-180荷瘤小鼠的抑瘤作用的实验中得出结论：心肌细胞条件培养液在体内具有抗肿瘤活性， 且无明显毒副作用。可以进一步实验研究帮助认识恶性肿瘤的转移机制。吴敬波、杨麟玲等学者[3]在心肌细胞培养液在裸鼠体内抑制人鼻咽癌细胞生长及其机制的实验做中得出结论：心肌细胞培养液在裸鼠体内可以有效抑制鼻咽癌细胞生长，抑瘤率达73.4%，其机制可能为诱导鼻咽癌细胞凋亡。到目前为止，这方面的研究尚在进行中。期待心肌细胞中所含有的这种(或这类)低分子抑瘤物被分离、纯化、鉴定出来，这样的新型天然抑瘤活性物质会为肿瘤提供高效稳定的治疗，为克服肿瘤带来新的希望。
2 心肌细胞生物分化诱导功能的研究
心肌细胞除了有抑瘤活性以外，在众多的研究中还发现，心肌细胞还具有生物分化诱导功能。由陈连凤[4]等人发明的专利中公开发明了一种在对干细胞向袭击组织细胞分化中应用的生物分化诱导剂，其为含有心肌细胞生长因子的营养液，由心肌细胞或心脏组织反复冻融裂解形成的心肌细胞裂解液，模拟了心肌微环境，可诱导干细胞分化为心肌样细胞还可诱导部分干细胞向内皮细胞方向分化，很好的建立细胞间连接，进行细胞传导，无毒副作用，具有很好的应用治疗前景。 随后，很多学者都在这方面进行了大量的实验研究。包括发现骨髓间充质干细胞、脂肪细胞等都可以被心肌细胞诱导分化向心肌样细胞分化。各国学者都在研究心肌细胞诱导分化的功能及其机制，发现心肌细胞的这种诱导功能为治疗心脏疾病，特别是心肌梗死有极大地意义和应用前景。
意大利Laura Lagostena等学者[5] 在培养小鼠骨髓中c - kit +细胞分化为心肌细胞的电生理特性实验的研究表明：小鼠骨髓造血干细胞的可塑性，可有限转分化成心肌细胞。德国Christina Mauritz等学者[6] 在功能性一代鼠心肌细胞诱导多能干细胞的实验中发现多能干细胞细胞分化成心肌细胞的功能。相对于胚胎干细胞，可以推导多能干细胞的细胞成形术与心肌组织工程自体心肌细胞的功能。美国Alessia Orlandi等学者[7] 在小鼠脐血CD34干细胞和心肌细胞共同培养获得的细胞功能特性的实验中发现，根据在他们的实验条件下，脐血CD34的细胞共同培养的小鼠心肌细胞的表现形成了类似心肌细胞兴奋收缩偶联的功能。但是人类特有的心脏基因表达RT - PCR则检测不到。美国Benedetta A. Pallante[8]等学者在骨髓Oct3 /4细胞通过年龄依赖旁分泌机制分化为心肌细胞的实验中发现：不论年龄，骨髓包含Oct3 / 4的干细胞具有分化成心肌细胞的能力.土耳其Zeynep Tokcaer-Keskin[9]等学者研究表明，间充质干细胞可以在体外培养较短的时间内向心肌细胞分化。这时候可能会提供获得紧急情况下减少细胞为基础的治疗，可能以前无法使用。在治疗急性心肌梗死(AMI)时，干细胞移植可以明显改善心功能。无论从改善心肌细胞，调节的改造，或损伤组织再生的保护心脏功能是否通过旁分泌机制，还在研究中。美国的Niladri Mal[10]等学者通过对间充质干细胞的SDF- 1在心肌梗死后表达，营养支持心肌细胞的研究，发现干细胞移植可能产生重大影响有利受伤器官功能独立的组织再生，SDF - 1的移植，主要是通过介导保护，而不是在心肌细胞再生的梗塞区。美国的Whittemore G. Tingley[11]等学者在小鼠胚胎干细胞衍生的心肌细胞中发现AKAP10牵连心律调节。人类胚胎干细胞(HESCs)由于其有潜在的能力，可能成为心脏修复，无限产生心肌细胞(CMCs)的重要细胞。日本的Teruhisa Kawamura[12]等学者发现：胚胎干细胞分化成心肌细胞的细胞需要心脏特异性基因程序激活，而最重要的就是乙酰化与GATA - 4，其参与了胚胎干细胞分化为心肌细胞。美国的P Gallo[13]等学者追踪发现人类胚胎干细胞的心肌细胞分化的启动子是一个有短肌钙蛋白慢病毒载体(TNNI3的LVVs)。美国的Nicolas Christoforou[14]学者小研究鼠胚胎干细胞衍生的心脏前体细胞的多能，并促进新型心脏基因的鉴定。新西兰的RA de Weger[15]等作者研究发现干细胞衍生的心肌细胞可以作为最好的心脏细胞移植。美国E. Martin-Rendon[16]等学者用5氮杂胞苷处理的从脐带血和骨髓中取得的人间充质干细胞，体外培养心肌细胞不会产生高频率的祖细胞，结果从脐带血中间充质干/祖细胞的分离得到的表型与骨髓干细胞的类似，异常的CD106，使得脐血干细胞表达欠缺，而CD146分子的高表达使得脐血干细胞表达增强。这里的结果表明这种细胞不产生足够频繁的心肌细胞修复心脏。他们在心脏修复效果很可能是由于旁分泌机制。美国Sepideh Heydarkhan-Hagvall[17]等学者研究的目的是确定人类脂肪干细胞(hASCs到心血管细胞)分化的关键外部和内部参数，最后发现人体脂肪干细胞是一种潜在的心血管细胞组织工程源。
3 展 望
可以看出，鼠源性心肌细胞不仅含有效的低分子抑瘤活性物质，可以分离、纯化、鉴定出来，为肿瘤的预防和治疗提供新的方向;而且具有强大的诱导分化功能，能使不同类型的细胞，包括胚胎干细胞、脂肪细胞等逐渐向心肌细胞方向发展，为各种心脏疾病，特别是心肌梗死的治疗带来希望。它的生物活性远远超出了我们的想象，这方面的研究还在继续深入进行研究中，我们期待有更新更好的发现，为人类带来更多的福音。
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[关键词] 胶质母细胞瘤；肿瘤干细胞；CD133；耐药
[中图分类号] R739.4 [文献标识码] A [文章编号] 1673-9701（2017）05-0012-03
脑胶质瘤是常见的原发中枢神经系统肿瘤，约占中枢神经系统恶性肿瘤的78%，占成人中枢神经系统肿瘤的50%，是恶性程度最高也是最具侵袭性的肿瘤之一[1，2]。目前脑胶质瘤治疗主要以最大限度切除实体肿瘤，术后辅以替莫唑胺化疗。化疗是目前治疗胶质瘤及改善预后的重要手段，但目前的治疗效果仍达不到满意，其中主要原因是肿瘤细胞的耐药性[3]。CD133是肿瘤干细胞和神经干细胞的特异性标志物，相关研究显示CD133+细胞具有较强的致瘤能力，CD133+细胞的多药耐药性明显增强[4]。而MRP-1、MDR1在异质性胶质瘤的脑肿瘤干细胞中的高表达是临床内在性耐药和个体耐药的主要原因之一[5]。而GST-π作为肿瘤转化的标志物之一，能够催化谷胱甘肽与亲电性的抗癌药物结合，通过活性将抗癌药物排出细胞，增强肿瘤的耐药性[6]。本研究初步分析MRP-1、MDR1及GST-π在CD133+肿瘤干细胞中的表达，为进一步研究确切的耐药机制及逆转耐药提供前期基础。
1 材料与方法
1.1材料与试剂
U251细胞系（广州赛业生物科技公司，货号：HCGUI-30001），DMEM/F12培养基、胎牛血清（FBS）购自Hyclone公司，胰蛋白酶（Gibco公司）、免疫磁珠（CD133+）细胞分选试剂盒、免疫磁珠分选仪购自Miltenyi Biotec公司，CO2恒温培养箱、-80℃超低温冰箱。
1.2 U251细胞复苏及培养
将保存人脑 U251 细胞的冻存管从-80℃冰箱中取出，立即置于37℃恒温水浴中，轻轻摇动冻存管使管内冻存液快速融化；将含U251细胞的冻存液移入15 mL无菌离心管中，加入约 5 mL含血清培养基，1000 r/min 离心5 min，弃掉上清液；加入约 3 mL含血清培养基重悬细胞，无菌透气培养瓶中，置于37℃、体积分数 5% CO2饱和湿度的培养箱中培养；观察细胞的生长情况，每3日更换一次培B液；将U251细胞在含10%的胎牛血清、青霉素 100 U/mL和链霉素100 μg/mL的DMEM 完全培养基中进行单层培养，置于37℃、5% CO2饱和湿度培养箱中连续培养传代。隔日换液1次，每次添加 4 mL培养基，每隔3 d进行细胞传代。
1.3 CD133+胶质瘤干细胞分选
收集培养基中连续培养的球样U251细胞，胰酶消化、离心后制备单细胞悬液，200 μm滤网过滤并计数。参照免疫磁珠（CD133+）细胞分选试剂盒、免疫磁珠分选仪操作说明进行。
1.4 CD133+胶质瘤干细胞培养及鉴定
将对数生长期的U251细胞用0.25%胰蛋白酶消化、离心后吹打成单细胞悬液，分别用无菌PBS液和DMEM/F12重悬细胞漂洗1遍，接种到含有EGF （20 ng/mL）、bFGF（20 ng/mL）、LIF（10 ng/mL）、B27（1×）的 DMEM/F12无血清培养基，置于37℃、5% CO2、饱和湿度培养箱中培养。细胞鉴定：取胶质瘤干细胞植入包被有多聚赖氨酸的玻片上，晾干，用PBS冲洗除去残留培养基；经4%多聚甲醛固定，5%山羊血清封闭；分别加入Nestin、β-tubulin 和 GFAP一抗，4℃过夜，加入FITC标记二抗，荧光显微镜镜检。
1.5 RT-PCR检测MRP-1、MDR1、GST-π mRNA的表达分析
采用Primer Premier v5软件设计MRP-1、MDR1、GST-π引物序列。MRP1 正义链：5'-GCAGGGCTACTTCTACACCG-3'，反义链：5'-TCATCGCCATCACAGCATTG-3'；MDR1：正义链：5'-CCCATCATTGCAATAGCAGG-3'，反义链：5'-GTTCAAACTTCTGCTCCTGA-3'；GST-π：正义链：5'-CCAATACCATCCTGCGTCAC-3'，反义链：5'-TCACTGTTTCCCGTTGCCCAT-3'。后收集细胞，参照相应试剂盒说明书提取总RNA，逆转录提取cDNA，配制PCR 反应体系（20 μL）进行PCR反应。以相同来源的β-actin为内部参照，相对基因表达量=2-CT（Ct=Ct 靶基因-Ct β-actin，Ct=Ct试验组-Ct 对照组），每个检测重复3次，计算 MRP-1、MDR1、GST-π mRNA表达量。
1.6统计学分析
应用SPSS19.0软件进行统计分析，计量资料以（x±s）表示，多组样本均数比较先进行正态分布及方差齐性检验，呈正态分布及方差齐性组间比较采用独立样本t检验，呈正态分布但方差不齐组间比较采用近似t检验，P
2结果
2.1胶质瘤干细胞的鉴定
胶质瘤U251干细胞经过Nestin、β-tubulin和GFAP荧光染色进行鉴定，结果U251干细胞球显示绿色荧光，呈强阳性表达。经过行GFAP和β-tubulin检测结果胶质瘤干细胞球未显示绿色荧光，呈阴性表达，经过培养基中诱导分化7 d后，胶质瘤U251干细胞GFAP、β-tubulin染色则细胞均显示绿色荧光，呈强阳性表达，见封三图6。
2.2 RT-PCR 检测MRP-1、MDR1、GST-π mRNA的表达分析
RT-PCR研究结果显示MRP-1、MDR1、GST-π在CD133+肿瘤干细胞中呈高度表达，而在CD133-细胞中表达显著低于CD133+细胞，差异有统计学意义（P
3 讨论
胶质母细胞瘤是中枢系统常见原发性肿瘤，患者虽及时接受完整的放疗和化疗联合治疗，预后仍较差，生存期H为12～18个月。尽管手术器械和手术方法已经得到极大改进，术后放疗和化疗等综合治疗措施也有明显改善，胶质母细胞瘤患者的中位生存时间仍无明显延长[7，8]。因此对胶质母细胞瘤的研究将具有持续的挑战性。鉴于胶质母细胞瘤是高度血管化的肿瘤，肿瘤的血管在肿瘤的侵袭和转移中起着重要的作用，因此，对胶质母细胞瘤的血管及其内皮细胞进行研究显得非常有意义。
以往研究认为，恶性肿瘤的生长依赖于肿瘤的血管生成。据此，有学者提出研发抗肿瘤血管生成药物达到治疗肿瘤的目的。但是，临床实践证明，这些药物的抗肿瘤效果非常有限并且容易获得耐药性[9-11]。因此，为研发更有效的抗肿瘤血管药物，我们需要对肿瘤的内皮细胞进行更深入的研究。研究证实在多种实体瘤中均含有极少数干细胞样的细胞，它们具有无限增殖、自我更新、多向分化的潜能及高致瘤性，这种干细胞样细胞被称为肿瘤干细胞。通过体外培养胶质瘤干细胞研究发现，胶质瘤干细胞具有自我增殖、多元分化的潜能。国外研究人员将胶质瘤干细胞与神经干细胞比较，胶质瘤干细胞的自我更新能力以及增殖能力均明显强于神经干细胞[12，13]。CD133+细胞在干细胞培养基中培养具有不断增殖、自我更新和分化的能力。我们在U251细胞系中分选CD133+细胞，实验显示其在无血清干细胞培养基中可以自我更新、无限增殖。经鉴定，分选获取的 CD133+细胞为胶质瘤干细胞。
MRP基因位于16p13.1染色体上，相关研究显示MRP能够通过改变胞浆和细胞器的pH值，降低药物到达作用部位的浓度，并且能够逆浓度梯度减少胞内药物浓度进而导致细胞耐药的发生，它同时也是一种ATP依赖泵，可以通过促进谷胱甘肽结合药物排出细胞外而减少细胞内药物的浓度，最终导致肿瘤耐药的发生[11]。而MRP-1、MRP-3基因在胶质瘤干细胞中的表达明显增多，与肿瘤耐药之间的关系相对肯定，已经成为研究和解决肿瘤耐药现象的重要靶位[14-16]。MDR1作为ABC超家族中的转运体多药耐药蛋白1能够逃脱药物的杀伤作用，从而导致化疗后肿瘤的复发和转移[17]。GST是一组与机体解毒作用有关的酶类，其中以GST-π与恶性肿瘤关系最为密切。GST-π以催化方式降解药物，以降低抗肿瘤药物的细胞毒作用而产生耐药性[18-20]。本研究结果证实MRP-1、MDR1、GST-π在CD133+细胞中呈现高表达，提示CD133+细胞的耐药机制可能与MRP-1、MDR1、GST-π表达增强有一定的关系，有可能成为胶质瘤干细胞治疗的新靶点，为进一步研究肿瘤的耐药机制以及肿瘤靶向治疗药物提供支持。
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【摘要】 目的 探讨激活骨骼肌肌卫星细胞的方法，提高肌卫星细胞的产量。方法 取成年Wistar大鼠18只，随机分为6组，给大鼠下肢腓肠肌注射心脏毒素，分别于注射心脏毒素后的当天、注射后1、2、3、4、5 d提取骨骼肌肌卫星细胞并计数，采用免疫荧光方法检测骨骼肌肌卫星细胞的纯度。结果 采用Percoll分离液提纯细胞，纯度能够达到80%。注射心脏毒素后3、4 d骨骼肌肌卫星细胞数最多，与其他时间比较，差异有显著性（F=5.540，q=4.576～5.829，P
【关键词】 卫星细胞，骨骼肌;细胞培养技术；大鼠，Wistar
骨骼肌肌卫星细胞属于成体单能干细胞，具有很强的分化增殖能力，位于骨骼肌纤维的肌膜和基底膜之间，通常情况下处于静息状态。组织损伤（包括体内环境的改变引起的创伤[1]）后，它们很快游走出来，增生并且融合起到修复和再生损伤肌纤维的作用。越来越多的研究证实，病变组织移植骨骼肌肌卫星细胞可以改善症状，为心力衰竭、骨坏死、断肢再生等提供了一种新的治疗途径。本研究旨在寻找合适的方法激活肌卫星细胞，从而提高细胞产量，为实验室研究及临床应用提供细胞来源。
1 材料与方法
1.1 实验材料
DMEM/F12（Gibco公司），Percoll分离液（Pharmacia公司），胎牛血清（杭州四季青生物材料研究所），胰蛋白酶、胶原酶Ⅰ（Sigma公司），小鼠抗大鼠Myosin、荧光标记羊抗小鼠IgG、多聚赖氨酸（武汉博士德生物工程有限公司），心脏毒素（中鑫东泰纳米基因生物技术有限公司）， 成年Wistar大鼠（青岛市药检中心）。
1.2 方法
1.2.1 模型制备 取18只大鼠随机分6组，各3只。下肢备皮消毒后，在腓肠肌处取3个点，每点注射10 mol/L心脏毒素0.1 mL，分别于注射当天、注射后1、2、3、4、5 d处死大鼠。
1.2.2 肌卫星细胞原代提取 取处理过的大鼠消毒、固定后，无菌条件下分别取左右下肢腓肠肌，用PBS冲洗血液，剔除结缔组织，将肌肉组织转移到青霉素小瓶，用眼科剪将其剪为肉糜，然后转移至15 mL的离心管，加入1 g/L的胶原酶Ⅱ约2 mL，在37 ℃水浴中慢速搅拌振荡消化约60 min，以150目金属过滤网过滤残余的肌管，并用PBS反复冲洗。取洗净后的肌管加入2.5 g/L胰蛋白酶4 mL消化15min，期间每隔5min震荡1次，加入4mL培养液中和蛋白酶，1 000 r/min离心10 min，弃上清，2 mL培养液重悬沉淀，以体积分数0.20、0.80的Percoll液非连续密度梯度离心法离心，室温、以3000 r/min离心10 min。离心管最上面2 mL为细胞混合液，其下方8 mL为体积分数0.20的Percoll液，最底层2 mL为体积分数0.80的Percoll液。取体积分数0.20与0.80 Percoll 液分界面处的细胞，用无血清培养基1 000 r/min离心清洗3次， 放入未用多聚赖氨酸处理的25 mL培养瓶中，置入37 ℃培养箱中孵育60 min，轻轻摇晃后倾倒出尚未贴壁的骨骼肌肌卫星细胞，计数并重新接种在预先用多聚赖氨酸处理过的培养瓶中。
1.3 骨骼肌肌卫星细胞培养及鉴定
将纯化后的骨骼肌肌卫星细胞培养96 h后换液，每3 d换液1次，密度达40%时用2.5 g/L 的胰蛋白酶进行消化， 以1∶2 的比例进行传代。取培养第3代的骨骼肌肌卫星细胞生长爬片，室温下通风干燥，40 g/L多聚甲醛固定30 min。吉姆萨染色观察细胞形态，免疫荧光染色计算骨骼肌肌卫星细胞阳性率。
1.4 统计学处理
采用SPSS软件进行数据处理，数据间比较采用方差分析。
2 结果
2.1 骨骼肌肌卫星细胞形态和生长情况
大鼠骨骼肌肌卫星细胞培养约48 h贴壁，为梭形或纺锤形，呈长轴平行排列，具有明显的方向性和较好的折光性，后呈现多形性，吉姆萨染色可更清楚地显示细胞形态。体外培养的大鼠骨骼肌肌卫星细胞在8代以内生长稳定，超过8代以后骨骼肌肌卫星细胞生长、分化能力下降。
2.2 免疫荧光染色
以Percoll液非连续密度梯度离心法分离、提纯获得的肌肌卫星细胞纯度能够达到80%。刚分离出的原代骨骼肌肌卫星细胞呈球形， 折光性强；培养2 d时细胞较少融合，多为椭圆形或圆形核的单核细胞，少数亦有双核，呈梭形和纺锤形;培养4 d的肌卫星细胞密度增大，单个细胞间相互交联成网。采用免疫荧光标记羊抗小鼠、小鼠抗大鼠Myosin染色可见约有80%的细胞染色阳性，呈纺锤形，可见绿色荧光信号。
2.3 注射心脏毒素后不同时间骨骼肌肌卫星细胞数量比较
注射心脏毒素后3、4 d骨骼肌肌卫星细胞数最多，与其他时间比较，差异有显著性（F=5.540，q=4.576～5.829，P
表1 注射心脏毒素后不同时间骨骼肌肌卫星细胞数比较（略）
与注射当天比较，F=5.540，*q=5.202、5.829，P
3 讨论
骨骼肌肌卫星细胞是成体骨骼肌中位于肌细胞膜和基膜之间的具有增殖分化潜力的细胞[2]，呈扁平状，有突起，具有移动性，1961 年由MAURO发现[3]。近年来的研究表明，骨骼肌细胞是一种有丝分裂后细胞，不能进行有丝分裂， 因而动物出生后肌细胞数目不发生明显的变化，但体积和核数目发生很大变化，其原因主要是由邻近的肌卫星细胞融入肌细胞中所致。肌细胞中DNA量及蛋白质合成能力增加， 使肌细胞得以增粗和增长，并且肌卫星细胞对骨骼肌受创伤后肌纤维的再生和修复也起着重要作用。一旦骨骼肌组织受损，肌卫星细胞就会被激活，大量分裂、增殖，相互融合形成肌纤维，填补受损部位。进一步研究表明，骨骼肌肌卫星细胞还具有干细胞抗原 Sca1 和CD34 等干细胞标记， 目前认为肌卫星细胞即肌源性干细胞，属于成体干细胞。最新研究显示，成体干细胞可以横向分化为其他类型的细胞和组织， 为干细胞的广泛应用提供了基础。近年来肌卫星细胞常被用于基因载体和组织工程方面的实验研究， 因此建立和完善肌卫星细胞的培养方法、获得高纯度细胞很重要。由于骨骼肌肌卫星细胞具有取材方便、免疫原性低、移植后存活时间长以及避免了胚胎干细胞的伦理学争论等优点， 今后定会在组织工程和基因治疗中被广泛应用。由于骨骼肌与心肌同属横纹肌，均起源于中胚层，分化过程有相似之处，自身有再生能力，体外易于培养，有较好的耐疲劳性和耐受缺血能力，已成为最优选的用于坏死心肌治疗的移植细胞之一。朱洪生等[4]报道，体外诱导骨骼肌肌卫星细胞分化为心肌细胞，表达特异性肌钙蛋白T，并可形成缝隙连接。另外也有文献报道，将骨骼肌肌卫星细胞移植入心肌梗死模型可明显改善心功能[4，5]。吕捷等[6]报道，骨骼肌肌卫星细胞可用于基因治疗。由于骨骼肌肌卫星细胞在体内含量少，所以如何有效地增殖肌卫星细胞成为制约此项技术应用的瓶颈。 转贴于
本实验采用两步消化法分离细胞，胶原酶对纤维结缔组织有良好的消化作用， 可将肌肉组织松解，利于胰蛋白酶将细胞从基膜消化和分离。分离得到的细胞为肌卫星细胞、成纤维细胞及组织碎片的混合物。其中的组织碎片可以通过换液除去，而成纤维细胞、血管内皮细胞作为细胞杂质很难去除。张玉石等[7]报道，利用流式细胞仪可获得纯度在99%以上的肌卫星细胞。由于实验条件的限制，本实验室采用150目金属网、Percoll细胞分离液[8]、差速贴壁法进行纯化， 得到肌卫星细胞纯度在80%以上。YABLONKA等[8]报道，肌卫星细胞在体外能够分化成肌小管、形成横纹，细胞融合，甚至可见收缩，可通过这种特异性形态学变化鉴定肌卫星细胞。本实验中控制血清浓度高于10%，细胞密度低于60%，未见细胞融合。此外，文献报道鉴定肌卫星细胞的方法包括: 检测骨骼肌特异磷酸肌酸激酶CKMM亚型、结蛋白、肌球蛋白(Myosin)、M钙黏蛋白及α 横纹肌肌动蛋白。本实验采用小鼠抗大鼠单克隆抗体对肌卫星细胞进行鉴定。成纤维细胞与骨骼肌内血管的平滑肌细胞不产生Myosin，由此可与肌卫星细胞鉴别。当然，用多种单克隆抗体进行免疫标记可以更好地对肌卫星细胞进行鉴定。本文结果显示，体外培养的骨骼肌肌卫星细胞开始呈现梭形或纺锤形， Myosin免疫组化检测显示SC呈阳性，证实培养细胞为骨骼肌肌卫星细胞。
骨骼肌再生模型主要包括：机械损伤、冰冻或化学诱导损伤。本实验向大鼠腓肠肌注射10 mol/L心脏毒素0.1 mL，心脏毒素与肌细胞膜上的受体结合后，使膜产生小孔，导致肌细胞除极及Ca2+内流，进而使肌细胞受损，可引起80%～90％的肌肉坏死。蛇毒诱导损伤后，从损伤肌管和吞噬细胞中局部释放出生长因子，吸引骨骼肌肌卫星细胞迁移到受损部位，并引起肌卫星细胞在损伤后的2～3 d内广泛增殖；大约在损伤4～5 d后，肌卫星细胞退出细胞周期，或自我更新，或形成分化的具有中央细胞核的肌管。利用这种方法，损伤的骨骼肌组织在损伤后的10 d时间内可以基本恢复。本文结果说明骨骼肌肌卫星细胞增殖高峰是骨骼肌受损后的3、4 d。在制作模型后的3～4 d，也就是在细胞产量最高时收获细胞，可为实验及临床提供细胞来源。本文实验提供了一种简单并可靠的细胞扩增方法。
综上所述，骨骼肌化学损伤可作为增加骨骼肌肌卫星细胞产量的一种方法。骨骼肌肌卫星细胞是一种很有前途的成体干细胞，如何使细胞增殖到所需数量是有待解决的问题。而且如何更好地提纯及培养骨骼肌肌卫星细胞也需要我们继续研究和探索。
【参考文献】
[1]闫凤霞，于向民，潘晓亮，等. 消瘿强肌汤治疗甲状腺功能亢进性肌病大鼠的形态学观察[J]. 青岛大学医学院学报， 2007，43(1):4042.
[2]MORGAN J E， PARTRIDGE T A. Cells in focus: muscle satellite cells[J]. Inter J Biochem & Cell Bio， 2003，35：11511156.
[3]MAURO A. Satellite cells of skeletal muscle fibers[J]. J Biophys Biochem Cytol， 1961，9:493498.
[4]朱洪生，卫洪超. 自体骨骼肌卫星细胞移植治疗急性心肌梗死的实验研究[J]. 中华医学杂志， 2000，80(11):873875.
[5]MENASCHE P. Skeletal muscle satellite cell transplantation[J]. Cardiovasc Res， 2003，58(2)：35l357.
[6]吕捷， 赵春礼，鲁强，等. 成年动物骨骼肌细胞原代培养及转染外源基因的初步研究[J]. 解剖学报， 2000，31(1):8789.
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