时间：2023-07-03 16:08:12
导语：在基因工程载体的种类的撰写旅程中，学习并吸收他人佳作的精髓是一条宝贵的路径，好期刊汇集了九篇优秀范文，愿这些内容能够启发您的创作灵感，引领您探索更多的创作可能。
关键词:生物技术;基因工程;细胞工程
现代生物技术的迅猛发展,成就非凡,推动着科学的进步,促进着经济的发展,改变着人类的生活与思维,影响着人类社会的发展进程。现代生物技术的成果越来越广泛地应用于医药、食品、能源、化工、轻工和环境保护等诸多领域。生物技术是21世纪高新技术革命的核心内容,具有巨大的经济效益及潜在的生产力。专家预测,到2010～2020年,生物技术产业将逐步成为世界经济体系的支柱产业之一。生物技术是以生命科学为基础,利用生物机体、生物系统创造新物种,并与工程原理相结合加工生产生物制品的综合性科学技术。现代生物技术则包括基因工程、蛋白质工程、细胞工程、酶工程和发酵工程等领域。在我国的食品工业中,生物技术工业化产品占有相当大的比重;近年,酒类和新型发酵产品以及酿造产品的产值占食品工业总产值的17%。现代生物技术在食品发酵领域中有广阔市场和发展前景,本文主要阐述现代生物技术在食品发酵生产中的应用。
一、基因工程技术在食品发酵生产中的应用
基因工程技术是现代生物技术的核心内容,采用类似工程设计的方法,按照人类的特殊需要将具有遗传性的目的基因在离体条件下进行剪切、组合、拼接,再将人工重组的基因通过载体导入受体细胞,进行无性繁殖,并使目的基因在受体细胞中高速表达,产生出人类所需要的产品或组建成新的生物类型。
发酵工业的关键是优良菌株的获取,除选用常用的诱变、杂交和原生质体融合等传统方法外,还可与基因工程结合,进行改造生产菌种。
(一)改良面包酵母菌的性能
面包酵母是最早采用基因工程改造的食品微生物。将优良酶基因转入面包酵母菌中后,其含有的麦芽糖透性酶及麦芽糖的含量比普通面包酵母显著提高,面包加工中产生二氧化碳气体量提高,应用改良后的酵母菌种可生产出膨润松软的面包。
(二)改良酿酒酵母菌的性能
利用基因工程技术培育出新的酿酒酵母菌株,用以改进传统的酿酒工艺,并使之多样化。采用基因工程技术将大麦中的淀粉酶基因转入啤酒酵母中后,即可直接利用淀粉发酵,使生产流程缩短,工序简化,革新啤酒生产工艺。目前,已成功地选育出分解β-葡聚糖和分解糊精的啤酒酵母菌株、嗜杀啤酒酵母菌株,提高生香物质含量的啤酒酵母菌株。
(三)改良乳酸菌发酵剂的性能
乳酸菌是一类能代谢产生乳酸,降低发酵产品pH值的一类微生物。乳酸菌基因表达系统分为组成型表达和受控表达两种类型,其中受控表达系统包括糖诱导系统、Nisin诱导系统、pH诱导系统和噬菌体衍生系统。相对于乳酸乳球菌和嗜热链球菌而言,德氏乳杆菌的基因研究比较缺乏,但是已经发现质粒pN42和PJBL2用于构建德氏乳杆菌的克隆载体。有研究发现乳酸菌基因突变有2种方法:第一种方法涉及(同源或异源的)可独立复制的转座子,第二种方法是依赖于克隆的基因组DN断和染色体上的同源部位的重组整合而获得。通过基因工程得到的乳酸菌发酵剂具有优良的发酵性能,产双乙酰能力、蛋白水解能力、胞外多糖的稳定形成能力、抗杂菌和病原菌的能力较强。
二、细胞工程技术在食品发酵生产中的应用
细胞工程是生物工程主要组成之一,出现于20世纪70年代末至80年代初,是在细胞水平上改变细胞的遗传特性或通过大规模细胞培养以获得人们所需物质的技术过程。细胞工程主要有细胞培养、细胞融合及细胞代谢物的生产等。细胞融合是在外力(诱导剂或促融剂)作用下,使两个或两个以上的异源(种、属间)细胞或原生质体相互接触,从而发生膜融合、胞质融合和核融合并形成杂种细胞的现象。细胞融合技术是一种改良微生物发酵菌种的有效方法,主要用于改良微生物菌种特性、提高目的产物的产量、使菌种获得新的性状、合成新产物等。与基因工程技术结合,使对遗传物质进一步修饰提供了多样的可能性。例如日本味之素公司应用细胞融合技术使产生氨基酸的短杆菌杂交,获得比原产量高3倍的赖氨酸产生菌和苏氨酸高产新菌株。酿酒酵母和糖化酵母的种间杂交,分离子后代中个别菌株具有糖化和发酵的双重能力。日本国税厅酿造试验所用该技术获得了优良的高性能谢利酵母来酿制西班牙谢利白葡萄酒获得了成功。目前,微生物细胞融合的对象已扩展到酵母、霉菌、细菌、放线菌等多种微生物的种间以至属间,不断培育出用于各种领域的新菌种。
三、酶工程技术在食品发酵生产中的应用
酶是活细胞产生的具有高效催化功能、高度专一性和高度受控性的一类特殊生物催化剂。酶工程是现代生物技术的一个重要组成部分,酶工程又称酶反应技术,是在一定的生物反应器内,利用生物酶作为催化剂,使某些物质定向转化的工艺技术,包括酶的研制与生产,酶和细胞或细胞器的固定化技术,酶分子的修饰改造,以及生物传感器等。酶工程技术在发酵生产中主要用于两个方面,一是用酶技术处理发酵原料,有利于发酵过程的进行。如啤酒酿制过程,主要原料麦芽的质量欠佳或大麦、大米等辅助原料使用量较大时,会造成淀粉酶、俘一葡聚糖酶、纤维素酶的活力不足,使糖化不充分、蛋白质降解不足,从而减慢发酵速度,影响啤酒的风味和收率。使用微生物淀粉酶、蛋白酶、一葡聚糖酶等制剂,可补充麦芽中酶活力不足的缺陷,提高麦汁的可发酵度和麦汁糖化的组分,缩短糖化时间,减少麦皮中色素、单宁等不良杂质在糖化过程中浸出,从而降低麦汁色泽。二是用酶来处理发酵菌种的代谢产物,缩短发酵过程,促进发酵风味的形成。啤酒中的双乙酰是影响啤酒风味的主要因素,是判断啤酒成熟的主要指标。当啤酒中双乙酰的浓度超过阈值时,就会产生一种不愉快的馊酸味。双乙酰是由酵母繁殖时生成的α-乙酰乳酸和α-乙酰羟基丁酸氧化脱羧而成的,一般在啤酒发酵后期还原双乙酰需要约5～10d的时间。崔进梅等报道,发酵罐中加入α-乙酰乳酸脱羧酶能催化α-乙酰乳酸直接形成羧基丁酮,可缩短发酵周期,减少双乙酰含量。
四、小结
在食品发酵生产中应用生物技术可以提高发酵剂的性能,缩短发酵周期,丰富发酵制品的种类。不仅提高了产品档次和附加值,生产出符合不同消费者需要的保健制品,而且在有利于加速食品加工业的发展。随着生化技术的日益发展,相信会开发出更多物美价廉的发酵制品,使生物加工技术在食品发酵工业中的应用更加广泛。
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关键词：DNA重组技术；限制酶；DNA连接酶；运载体
中图分类号：G632 文献标识码：B 文章编号：1002-7661（2014）10-207-01
一、教材分析
“DNA重组技术的基本工具”是人教新课标教材选修3专题一“基因工程” 1.1的内容。本节主要介绍了DNA重组技术的三种基本工具及其作用。教材内容较为抽象，为了更好的让学生理解DNA重组技术的三种基本工具，教材提供了较多的教学素材。例如，通过图片的展示，让抽象的语言在直观的插入中找到注释；通过模拟制作活动，让学生在实际动手中形成正确认识；教材还采用了“生物技术资料卡”的形式，对特别名词进行了诠释，扩展学生的知识面。
二、教学策略
采用问题引导、小组讨论的策略，构建了三个学习任务：1）限制性核酸内切酶――“分子手术刀”；2）DNA连接酶――“分子缝合针”；3）基因进入受体细胞的载体――“分子运输车”。通过问题情境引导学生在思索中学习新知识；通过模拟操作使学生对基因工程的认识形象化；通过组内互助，锻炼学生交流与合作的能力；通过质疑点拨及归纳交流引导学生思考，归纳总结。
三、三维目标
1）知识目标：了解基因工程的基本概念；简述DNA重组技术所需的三种基本工具及其作用。
2）能力目标：通过分析文字材料，培养学生归纳总结的能力；通过学生动手操作重组DNA模型，培养学生的动手能力。
3）情感目标：通过小组活动，培养学生合作精神；通过材料分析，使学生认同基因工程的诞生和发展离不开理论研究和技术创新。
四、教学过程
1、复习引入
回顾：①一百年前，中国人甚至全世界人有种植抗虫棉的吗？②棉花本身有抗虫基因吗？③抗虫基因从哪来？④培育抗虫棉利用的是哪种育种方法？
通过层层递进的设问，可以使学生从理性思维的角度逐渐回忆出“基因工程的概念”。从而使学生回忆起基因工程又叫做DNA重组技术，引向题目。
过渡：大家都知道DNA是非常小的，它的直径只有我们头发丝的十万分之一。俗话说“工欲善其事，必先利其器”，要想把其它生物的抗虫基因转移到棉花细胞内，就必须要有精密的工具。那么这些工具是什么呢？
2、限制性核酸内切酶――“分子手术刀”
学习任务一: 阅读教材“限制性核酸内切酶――‘分子手术刀’”相关内容，小组讨论归纳答案：①什么是限制酶？它的来源是哪？②限制酶与我们学过的DNA 酶相同吗？③限制酶的作用是什么？④限制酶所识别的序列有什么特点？举例说明⑤限制酶切割的是什么键？⑥限制酶切割后的结果是怎样的？举例说明⑦什么是粘性末端？什么是平末端？两者的区别？
以上问题，学生都可以用以前学过的知识以及书上的生物知识回答，如果遇到困难，教师可以给予适当提示与引导，使学生明确限制酶的来源、作用、特点、结果等。教师可以强调一下识别序列的规律：限制酶所识别的序列，都有中心轴线，中心轴线两侧双链DNA上的碱基是反向对称，重复排列的，称回文序列。如图1所示：
自学检测：1.关于限制酶的说法正确的是A．限制酶是一种酶，只识别GAATTC碱基序列B．EcoR1切割的是G-A之间的氢键C．限制酶一般不切割自身的DNA分子，只切割外源DNAD．限制酶只存在于原核生物中质疑点拨：学生组内讨论展示答案后，由组内同学进行自查自纠，如果有学生答不上来的问题，教师进行解答。如果学生没有疑问，教师可以进行反问：如，将来源不同的DN段连接在一起，需要用同一种限制酶来切吗？
3、DNA连接酶――“分子缝合针”
学习任务二：阅读教材“DNA连接酶――‘分子缝合针’”相关内容，小组讨论归纳答案：①什么是DNA连接酶？它与DNA聚合酶相同吗？②DNA连接酶作用的化学键是什么？③DNA连接酶有哪些种类？其来源和特点分别是什么？
自学检测：2.DNA连接酶催化的反应是A．DNA复制时母链与子链之间形成氢键B．粘性末端碱基之间形成氢键C．两个DN段粘性末端之间的缝隙的连接D．A、B、C都不正确
质疑点拨：反问：DNA连接酶与DNA聚合酶是一回事吗？为什么？
4、基因进入受体细胞的载体――“分子运输车”
学习任务三：阅读教材“基因进入受体细胞的载体――‘分子运输车’”小组讨论归纳答案：①基因工程的作用是什么？②基因工程载体包括哪些？③什么叫质粒？④质粒作为载体必须满足的条件有哪些？
自学检测：3.下列哪项不是基因工程经常使用的，用来运载目的基因的载体
A.细菌质粒B.噬菌体C.动植物病毒D.细菌核区的DNA
质疑点拨：想一想，具备什么条件才能充当“分子运输车”？
归纳交流：转基因抗虫棉的基本操作工具及其作用。
摘要生物柴油由于其燃烧性高、污染小、可再生等优点，是传统化石燃料的理想替代能源，并已在世界范围内得到广泛应用。基因工程技术在生物柴油中的应用，主要集中在提高生物柴油原料的脂类含量上，如对含油植物和含油微藻的研究。结合国内外主要研究进展，综述了运用基因工程技术提高生物柴油原料脂类含量的8种途径，如超量表达乙酰辅酶A羧化酶、脂肪酸合成酶、苹果酸酶等。最后指出:将微藻作为生产原料是我国生物柴油产业发展的必然趋势，通过转录因子途径调控脂类的积累，是未来生物柴油产业发展的重要研究方向。
关键词基因工程;生物柴油;应用;脂类含量;微藻
AbstractBiodiesel，due to its advantages of better burning performance，lower pollution，renewable feature etc.，is the ideal alternative energy source oftraditional fossil fuels and has been widely used in the world.The application of gene engineering in biodiesel production is mainly on improving the lipid content of biodiesel raw materials，such as oil plants and oil microalgae.In this paper，according to the research progress at home and abroad，the application of gene engineering in eight channels to improve the lipid content of biodiesel raw materials were reviewed.At last，it isconcluded that using microalgae as a feedstock is inevitable trend of biodiesel industry’s development in China.With the transcription factor pathway regulating lipid accumulation is an important research direction in the future development of biodiesel industry.
Key wordsgene engineering;biodiesel;application;lipid content;microalgae
社会的发展加速了人类对能源的消耗，能源问题已成为各国亟待解决的世界性问题。统计显示:全球石油探明储量仅供生产40年，这更为人类敲响了能源危机的警钟。此外，化石能源燃烧过程中会产生大量CO2，引起的温室效应将直接影响人类的生存环境。因此，为解决能源和环境问题，世界各国都在积极地寻找新能源，以应对将来可能发生的能源危机。生物柴油作为生物能源的一种，越来越得到各国的重视。与化石柴油相比，生物柴油具有闪点高、燃烧性高、污染小、可再生等优点，是化石燃料的理想替代能源[1]。
生物柴油原料的油脂含量是制约生物柴油发展的一大瓶颈。运用基因工程技术，克隆并特异性表达调控脂类合成相关酶的基因，从而提高生物脂肪酸含量并改变其组分以适应生物柴油发展的需要，是目前解决这一难题的有效手段。本文结合基因工程技术的应用现状，综述了基因工程在改造生物柴油原料中的研究进展，以期对生物柴油产业的发展提供一定指导。
1基因工程概述
基因工程，又称DNA重组技术，是指在基因水平上，以人工的方法取得目的基因，在体外重组于载体上，形成重组DNA分子，然后将重组DNA分子转入受体细胞进行复制、转录和翻译，从而产生人们所需要的目的基因的产物。基因工程技术打破了天然物种屏障，人们可以按照主观愿望，将来自不同生物体的DNA 片段组合到一起，并获得新的表达产物。
基因工程技术促进了生物学的迅猛发展，为解决生命科学领域的一些重大问题提供了强有力的手段，现已广泛应用于农业、医学、食品和环境保护等诸多领域。如培育抗虫、抗病、抗寒、抗旱农作物新品种，生产基因工程药物和可降解有毒物质的工程菌等。同样，在生物柴油的生产中，运用基因工程提高生物柴油原料的油脂含量，也逐步取代了传统方法，并取得了显著的效果。
2基因工程在生物柴油中的应用
生物柴油作为一种新型可再生能源，其生产原料主要为含油植物，如大豆、油菜、棕榈和蓖麻等。此外，将含油微藻作为生物柴油原料，也在逐渐成为一个新的研究领域。用微藻生产生物柴油具有更多优势，缪晓玲等[2]利用小球藻生产的生物柴油，不仅具有传统化石柴油相当的密度、粘度和热值，而且具有更低的冷滤点和良好的发动机低温启动性能。
迄今，基因工程技术在生物柴油中的应用，主要集中在提高含油植物的脂类含量上。虽然在含油微藻方面也有一些研究，但也主要借鉴对含油植物的研究方法。下面结合国内外主要研究方向，综述基因工程在提高生物柴油原料中脂类含量的研究进展。
2.1乙酰辅酶A羧化酶(ACCase)
乙酰辅酶A羧化酶(Acetyl-CoA carboxylase，ACCase)是脂肪酸生物合成的关键酶，它催化脂肪酸合成的第一步反应，即催化乙酰辅酶A生成丙二酸单酰辅酶A[3-6]。生物中的ACCase有2种类型:一是异质型，存在于细菌、双子叶植物和非禾本科单子叶植物等的质体中，由BC(生物素羧化酶)、BCCP(生物素羧基载体蛋白)、α型CT(羧基转移酶)和β型CT(羧基转移酶)等4个亚基组成[7-8];二是同质型，存在于动植物、酵母、藻类等的胞质溶胶中，由单亚基组成[9-12]。有研究表明，植物脂肪酸含量与ACCase的活性呈正相关。为了提高含油植物的脂肪酸含量，许多研究者进行了超量表达ACCase的试验。其中，Roesler等将一个叶绿体转移肽和napin启动子与拟南芥同质型ACC1基因融合，然后转化甘蓝型油菜。结果发现，转基因油菜的T1代成熟种子中ACCase的活性增加了1.7~1.9倍，总的含油量约增加了5%。由于ACCase过量表达，也改变了种子脂肪酸的组成[13]。Ohlrogge等[14]用同样的方法转化油菜，获得的转基因油菜T1代成熟种子中ACCase的活性增加了1.7~1.9倍，脂肪酸含量增加了6%。
许多学者研究了ACCase不同亚基在脂肪酸合成中的作用。Alisa等克隆和表达了油棕β-羧基转移酶基因(accD)和生物素羧化酶基因(accC)，研究表明accD基因的表达在维持异质型ACCase的水平及植物种子的含油量中起着最重要的作用。这个研究也首次证明了高水平accD基因的表达，会产生高水平的含油量[15]。此外，Madoka等[16]、Kode等[17]分别采用超量表达和基因敲除技术方法研究了accD基因，结果显示accD基因编码的β-CT亚基是ACCase的限制因子。
对于含油微藻乙酰辅酶A羧化酶的研究比较少，Dunahay等[18]首次报道了含叶绿素微藻的遗传转化。在此试验中，他利用硅藻的遗传转化系统，超量表达ACCase基因(acc1)，初步结果显示，转基因硅藻中ACCase的活性增加了2~3倍。
2.2脂肪酸合成酶(FAS)
脂肪酸合成过程中，乙酰辅酶A经乙酰辅酶A羧化酶催化转变为丙二酰辅酶A后，脂肪酸合成酶(FAS)就以丙二酰辅酶A为底物，继续进行脂肪酸的合成[19]。在植物中，FAS由ACP(酰基载体蛋白)和其他6种酶构成。其中，Dehesh等克隆了编码菠菜酮酰-ACP合酶(KASⅢ)的cDNA基因，使其在烟草、拟南芥和橄榄型油菜中超量表达。结果与正常植株相比，饱和脂肪酸(16∶0)都有所增加，不饱和脂肪酸含量下降[20]。
2.3酰基辅酶A:甘油二酯酰基转移酶(DGAT)
酰基辅酶A:甘油二酯酰基转移酶(acyl CoA:diacylgy-cerol acyltransferase，DGAT)是一种完整的内质网细胞微粒体酶，是催化三酰甘油(triacylgycerol，TAG)合成的最后一步反应的酶，也是甘油三酯合成过程中唯一的关键酶和限速酶。该酶的主要作用机制是使二酰甘油(diacylgycerol，DAG)加上脂肪酸酰基辅酶A形成三酰甘油[21-24]。Jako等首次在野生型拟南芥中，超量表达了种子特异性DGAT的cDNA，结果DGAT的活性增加了10%~70%，种子含油量也有显著增加[25]。Zhang等构建了特异hpRNA(具发夹结构的双链RNA)，用它沉默烟草内源性DGAT1基因，转基因植株的成熟种子含油量下降了9%~49%[26]。
2.4乙酰辅酶A合成酶(ACS)
乙酰辅酶A合成酶不可逆的催化醋酸形成乙酰辅酶A，而乙酰辅酶A可以为脂类的合成提供原料。Roughan等发现乙酰辅酶A合成酶可以将醋酸转化为乙酰辅酶A，并进入脂类合成途径[27]。Lin等在大肠杆菌体内超量表达了其自身乙酰辅酶A合成酶基因(acs)，与对照组相比，乙酰辅酶A合成酶的活性增加了9倍，同时也加速了脂类的生物合成[28]。
2.5ATP-柠檬酸裂解酶(ACL)
ATP-柠檬酸裂解酶催化柠檬酸形成乙酰辅酶A和草酰乙酸，乙酰辅酶A可以为脂类的合成提供原料。Ratledge等研究了ACL的活性与甘蓝型油菜种子脂质积累的关系，发现在种子快速合成脂质过程中，ACL和乙酰辅酶A羧化酶一样，其活性达到最大[29]。Rangasamy等研究了老鼠肝脏ACL基因在烟草质体中的异源超量表达，结果表明超量表达老鼠ACL基因，使烟草质体中总ACL活性增加了4倍，脂肪酸的合成也增加了16%[30]。
2.6苹果酸酶(ME)
苹果酸酶以NADP+为辅酶，催化苹果酸脱氢产生丙酮酸和NADPH，NADPH可用为脂肪酸合成中的还原反应。于是有人提出通过超量表达苹果酸酶，为脂肪酸合成提供充足的还原动力，从而达到提高脂肪酸含量的目的。Wynn等[31]发现苹果酸酶为构巢曲霉(Aspergillus nidulans)的脂质积累提供主要的还原动力NADPH。随后，Wynn等又进一步研究了NADPH与脂质积累之间的关系。即在丝状真菌中超量表达苹果酸酶，结果有大量NADPH生成，为脂类的合成提供了充足的还原动力，同时也增加了脂质的积累[32]。Zhang等在卷枝毛霉(Mucor circinelloides)中超量表达了苹果酸酶，结果发现苹果酸酶的活性增加了2~3倍，同时脂质的生物合成也增加了2.5倍[33]。
2.7β-氧化途径
脂肪酸的β-氧化途径，是生物体内脂肪酸降解的主要途径，它发生于原核生物的细胞溶胶及真核生物的线粒体基质中。因此，有研究者提出限制脂肪酸β-氧化途径的发生来提高含油植物的脂类含量。其中，Hara等用念珠菌研究了β-氧化途径中的关键酶——酰基辅酶A氧化酶，阻断对该酶所有基因的编码，并希望能增加二羧酸的生成。但结果相反，重组体念珠菌不能利用烷烃，也不能生产二羧酸[34]。由于直接对β-氧化途径关键酶的研究有一定的局限性，Cao等从酯酰辅酶A跨膜转运的角度，对提高念珠菌二羧酸生成进行了研究。在其研究中，通过对肉碱-酯酰转移酶(CAT)基因在重组体中的特异表达，发现当CAT的活性减少1/2时，二羧酸的产率增加了21.0%，对烷烃的转化能力增加了12.0%。但是，如果将CAT基因全部敲除，则重组体不能利用烷烃生产二羧酸[35]。
2.8磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(PEPase)
许多研究者发现油菜蛋白质含量与油脂含量呈负相关，于是有人提出对应的反义技术调控植物油脂含量。陈锦清等[36]提出油脂和蛋白质的“底物竞争”假说，认为葡萄糖酵解产物——丙酮酸是油脂和蛋白质合成的共同底物，2种物质在合成中竞争丙酮酸。乙酰辅酶A羧化酶(ACCase)和丙酮酸羧化酶(PEPCase)分别是这2种物质合成的关键酶，它们的相对活性就决定了丙酮酸的流向。在这项研究中，他将根癌农杆菌EHA101携带反义PEP基因，然后转化甘蓝型油菜——浙油758和浙优油1号的下胚轴，成功地获得了转基因植株。对浙油758转基因植株的含油量测定显示，种子平均含油量比对照组高6.4%。对浙优油1号转基因植株的油脂及蛋白质含量测定表明，种子平均含油量比对照组高16.7%，其中1株油菜蛋白质含量下降9.7%。对转基因植株及对照组种子的油脂和蛋白质含量进行回归分析表明，2种植株的油脂和蛋白质含量呈显著负相关。张银波等构建了PEP基因的RNAi载体，希望通过抑制蛋白质的合成以使丙酮酸转向油脂的合成。由于RNAi技术的有效性及简易性，若该载体成功实现抑制目的基因，则可以为高油作物的培育开辟新的途径[37]。微藻PEPase的研究借鉴对含油植物的研究方法，其中宋东辉等采用反义PEP技术调控微藻PEPase的代谢途径，初步结果显示，反义抑制PEPase酶活性可以显著提高微藻脂类含量[1]。
3结语
生物柴油具有可再生、污染小、燃烧性高等优点，是一种新型环保可再生能源，具有极广阔的应用前景。目前，世界生物柴油的生产原料主要为含油植物，但根据我国食用油尚需大量进口的情况，不可能将植物油大规模用于生产生物柴油。而且我国土地资源有限，大幅度增加含油植物种植面积难度很大。因此，若要大规模发展我国生物柴油产业，必须寻找其他的生物柴油原料。利用微藻生产生物柴油可以很好地解决上述问题。微藻生长周期短，生长速率快，光合作用效率高，而且不占用农业用地，可以利用微生物发酵技术，在光反应器中高密度培养。因此，将微藻作为生产原料是我国生物柴油产业发展的必然趋势。
目前，国内外运用基因工程技术生产生物柴油还处于初级阶段，多采用单基因的特异表达提高脂类含量水平。但脂类的积累涉及到脂类的生物合成及分解代谢，是一个复杂的系统，不可能通过特异的表达一种基因来大大提高脂类含量。针对以上问题，已有学者提出转录因子途径调控脂类的积累。该途径的主要优势在于，转录因子参与调控代谢途径中的一系列基因。因此，可以通过调控相关转录因子，进而带动代谢途径中的一系列基因超量表达，使脂类水平大大提高。
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知识点一、大肠杆菌在分类上属于细菌，原核微生物。
例题一：下列生物中，均由真核细胞组成的一组生物是（ ）
A、小麦、大肠杆菌 B、酵母菌、蝗虫
C、蓝藻、团藻 D、人、流感病毒
解析：流感病毒为非细胞型生物，大肠杆菌和蓝藻为原核生物。小麦、酵母菌、蝗虫、团藻、人是真核细胞构成的真核生物。故答案为B。
知识点二、大肠杆菌的新陈代谢类型为异养厌氧型。
例题二：下列微生物的新陈代谢类型属于异养厌氧型的生物是（ ）
A、根瘤菌 B、圆褐固氮菌 C、大肠杆菌 D、反硝化细菌
解析：根瘤菌、圆褐固氮菌的新陈代谢类型是异养需氧型，大肠杆菌的新陈代谢类型是异养厌氧型，反硝化细菌在缺氧环境中可以将硝酸盐转化为亚硝酸盐并最终转化为氮气，其新陈代谢类型是异养厌氧型。故答案为C 、D。
知识点三、大肠杆菌在生态系统中的地位：在生态系统中能够将动植物的遗体、排出物和残落物中所含的有机物，逐渐分解成无机物，归还到无机环境中，被绿色植物重新利用，所以属于生态系统中的分解者。
例题三：下列微生物中属于分解者的是（ ）
A、根瘤菌 B、蓝藻 C、大肠杆菌 D、硝化细菌
解析：根瘤菌与豆科植物互利共生，是消费者。蓝藻是光能自养型生物，硝化细菌是化能自养型生物，都属于生产者。只有大肠杆菌是分解者。故答案为C.
知识点四、大肠杆菌的细胞结构
大肠杆菌为原核细胞构成，结构比较简单，与真核细胞相比，最主要的特点是没有核膜包围的典型的细胞核。细胞表面有一层坚固的细胞壁，主要成分是由糖类与蛋白质结合而成的化合物，细胞膜的化学组成和结构与真核细胞相似，细胞质内没有高尔基体、线粒体、内质网和叶绿体等复杂的细胞器，有分散的核糖体、质粒，细胞内含有丝状的区域叫做拟核，DNA分子上不含有蛋白质成分，所以没有真核细胞所具有的染色体。特殊结构有荚膜、鞭毛和芽孢。
例题四： 大肠杆菌在生长时，细胞内钾离子的质量分数是培养液的3000倍。如果在培养液中加入不影响细胞呼吸作用的药物，大肠杆菌细胞内钾离子的质量分数立即下降，这种药物的作用是（ ）
A、破坏了线粒体的结构 B、抑制了细胞内呼吸酶的活性
C、破坏了细胞内的遗传物质 D、抑制了细胞膜上载体的活性
解析： 大肠杆菌为原核生物，细胞内无线粒体。钾离子是通过主动运输被吸收的。此药物不影响呼吸作用，则ATP可正常合成，所以只考虑载体的情况。故答案为D。
知识点五、大肠杆菌的遗传物质和基因结构：大肠杆菌为原核细胞构成，其拟核中有一个大型的环状DNA分子，控制着大肠杆菌的主要遗传性状，细胞质中含有质粒，质粒上面含有几个到几百个基因，控制着大肠杆菌的抗药性、固氮、抗生素生成等性状。构成大肠杆菌的基因是由成百上千个核苷酸对组成的，包括能够编码蛋白质的编码区和编码区上游和下游不能编码蛋白质的非编码区，编码区是连续的，不间隔的。
例题五：下列有关大肠杆菌遗传物质的叙述正确的是（ ）
A、大肠杆菌只有拟核中含有遗传物质
B、大肠杆菌的基因中只有外显子，没有内含子
C、大肠杆菌基因结构中的非编码序列是位于编码区上游和下游的核苷酸序列
D、大肠杆菌基因结构中的非编码序列是位于编码区上游和下游的核苷酸序列和编码区中的内含子
解析：大肠杆菌为原核细胞构成，其拟核和质粒中都有基因，原核细胞基因是连续的，不间隔的，无外显子和内含子之分。故答案为C。
知识点六、大肠杆菌在基因工程中的作用：在基因工程中大肠杆菌可作为受体细胞，细胞中的质粒可以作为运输目的基因的运载体。例如：将大肠杆菌的质粒取出，连接上人生长激素基因后，重新置入大肠杆菌的细胞内，然后，用这种带有人生长激素基因的工程菌进行发酵，就能得到大量的人生长激素。
例题六：1979年，科学家将动物体内能够产生胰岛素的基因与大肠杆菌的DNA重组并且在大肠杆菌内表达获得成功。下列有关说法错误的是（ ）
A、胰岛素基因和大肠杆菌的DNA重组时，需要DNA连接酶
B、通常用一种限制性内切酶处理人的胰岛素基因，用另一种酶处理大肠杆菌的质粒DNA
C、检测胰岛素基因是否进入了大肠杆菌，通常根据受体细胞是否具有质粒特有的某种抗性来确定
D、将胰岛素基因导入大肠杆菌后，由于大肠杆菌繁殖的速度非常快，因此在短时间内就能获得大量的胰岛素
解析：基因工程中要用同一种限制性内切酶切取目的基因和运载体，以露出相同的黏性末端，两者的黏性末端黏合时，需要DNA连接酶。作为运载体，大肠杆菌的质粒要具有标记基因。大肠杆菌为原核生物，体积小，繁殖速度快，在发酵工程中被广泛应用。故答案为B。
知识点七、大肠杆菌的鉴定：在微生物培养基中加入伊红和美兰，如果有大肠杆菌，其代谢产物（有机酸）就与
伊红和美兰结合，使菌落呈深紫色，并带有金属光泽。
例题七：如果大肠杆菌和圆褐固氮菌混合，采用下列哪组培养基可将大肠杆菌鉴别，将圆褐固氮菌分离（ ）
A、无氮培养基和牛肉膏蛋白胨培养基 B、加食盐培养基和牛肉膏蛋白胨培养基
C、加青霉素培养基和伊红-美兰培养基 D、伊红-美兰培养基和无氮培养基
关键词：限制酶 筛选
一、单酶切及筛选
若用同一种限制酶切割质粒和目的基因形成相同的四个黏性末端，因而可能出现多种连接方式如：①质粒和质粒；②目的基因和目的基因；③质粒的自身环化，目的基因的自身连接；④质粒与目的基因的连接。质粒与目的基因的连接又会出现正向连接和反向连接两种。若启动子在质粒上，目的基因与质粒的反向连接则导致三联体密码顺序改变，起始密码子和终止密码子位置改变，使得翻译不能正常进行而无法得到正常的表达产物。
例1： （2012江苏生物高考33题部分）图2表示一种质粒的结构和部分碱基序列。现有Msp I、BamH I、Mbo I、Sma I4种限制性核酸内切酶，它们识别的碱基序列和酶切位点分别为CCGG、GGATCC、GATC、CCCGGG。请回答下列问题。
■
若将图2中质粒和目的基因D通过同种限制酶处理后进行连接，形成重组质粒，那么应选用的限制酶是 。在导入重组质粒后，为了筛选出含重组质粒的大肠杆菌，一般需要用添加 的培养基进行培养。经检测，部分含有重组质粒的大肠杆菌菌株中目的基因D不能正确表达，其最可能的原因是 。答案： BamH I，抗生素B，同种限制酶切割形成的末端相同，部分目的基因D与质粒反向链接。
笔者认为可通过免疫学方法检测目的基因的表达产物排除反向连接的重组质粒，或分别在质粒和目的基因上设计相同的限制酶识别位点，然后用该酶去切割重组质粒，正向连接和反向连接便会得到不同长度的DN段，再根据已知的限制酶在目的基因的位置进行比对，找到正确连接的重组质粒。
二、双酶切及筛选
因为用单酶切会出现质粒与目的基因的任意连接，所以在实际操作中多使用双酶切。双酶切可以避免质粒的自身环化，目的基因的自身连接和目的基因和质粒的反向连接，而目的基因与目的基因的连接因为没有抗生素抗性基因所以可以在含有该抗生素的培养基上去除，故只剩下质粒与质粒，以及质粒与目的基因的重组体。
（一）插入失活筛选法
例2：（苏锡常镇2012届高三教学调研测试）MseI，EcoRI，PstI识别的碱基序列和切割位点分别为GAATTAATTC，GAATTC，CTGCAG。请回答下列问题：
（1）在用图中的质粒和外源DNA构建重组质粒时，需要对质粒改造，构建新的限制酶切位点。试写出构建需要的限制酶切位点的过程（提供构建需要的所有条件）：
①首先用 酶处理质粒；
②然后用DNA聚合酶等处理质粒；
③再运用 酶处理质粒，从而形成新的限制酶切位点，可被 酶识别。
（2）基因工程中的检测筛选是一个重要的步骤。下图表示运用影印培养法（使在一系列培养皿的相同位置上能出现相同菌落的一种接种培养方法）检测基因表达载体是否导入大肠杆菌。
■■
图3
培养基除了含有细菌生长繁殖必需的成分外，培养基A和培养基B分别还含有 ，
。从检测筛选的结果分析，含有目的基因的是 菌落中的细菌。答案：（1）EcoRI，DNA连接，MseI（2）四环素 青霉素（四环素和青霉素）4和6
用限制酶MseI和 PstI同时切割含目的基因的DNA和质粒，但原有质粒上无MseI识别位点，需利用EcoRI识别位点重新构建MseI识别位点。
在抗青霉素基因内部具有重新构建的MseI识别位点，当用MseI和Pst I同时切割含目的基因的外源DNA和质粒，由于目的基因的插入，导致抗青霉素基因出现功能性失活，于是所形成的重组质粒都将具有四环素抗性和对青霉素敏感。将转化的细菌接种在含四环素的培养基上，一段时间后可得到全部受体菌菌落，将灭菌的绒布按到培养基上，使绒布面沾上菌落，然后将绒布按到含青霉素的培养基上。含重组质粒的受体菌能在四环素培养基上生长却无法在青霉素培养基上上生长。上题实际是运用插入失活效应检测外源DNA。
根据插入失活原理设计的筛选重组体分子的方法，需要进行菌落平板的影印复制，才能识别出由此而丧失的表型特征，这会给重组体的筛选工作增加不少麻烦，由此而发展出β-半乳糖苷酶显色反应选择法。
（二）β-半乳糖苷酶显色筛选法
例3：（盐城市2012届高三二模）大肠杆菌pUCl8质粒上的LacZ基囚可表达出β-半乳糖苷酶，当培养基中含有IPTG和X-gal时，X-gal便会被β-半乳糖苷酶水解成蓝色，大肠杆菌将形成蓝色菌落；反之，则形成白色菌落。由此推知，选择培养基中除含有大肠杆菌必需的葡萄糖、氮源、无机盐、水、生长因子等营养物质外，还应加入 物质。成功导人重组质粒的大肠杆菌在培养基中形成 色的菌落，原因是 。
■
图四
选择培养基中除含有大肠杆菌必需的葡萄糖、氮源、无机盐、水、生长因子等营养物质外，还应加入IPTG，X-gal和氨苄青霉素。只有导入质粒的大肠杆菌才能在含有氨苄青霉素的培养基上生长繁殖，而重组质粒中的LacZ基囚因插入目的基因不能正常表达，所以无法表达β-半乳糖苷酶，培养基呈白色。答案：IPTG X-gal 氨苄青霉素：白色；重组质粒中的LacZ基因因插入目的基因而不能表达。
三、平端位点问题
构建重组质粒时常会出现平端位点，平端DNA可用T4DNA连接酶连接，平端连接可使载体和外源DNA连接序列上的原有限制位点消失，而不含外源插入DNA的载体，经自连成环后仍保留原有的限制位点。基于这一特性，使用特定限制酶处理连接混合物将能专一性地使自连载体DNA线性化，能抗酶解的重组DNA则依然保持环状。
参考文献：
关键词:生化技术;发酵工程;食品；应用
在我国的食品生产工业中,生化技术工业化产品占有相当大的比重。随着酒类和新型发酵产品以及酿造产品的产值在食品工业总产值的比重不断提升，现代生化技术在食品发酵工程中的应用有着广阔的发展前景。
一、食品生化技术和发酵工程简介
食品生化技术是现代生物技术在食品领域中的应用，是指以现代生命科学的研究成果为基础，结合现代工程技术手段和其他学科的研究成果，用全新的方法和手段设计新型的食品和食品原料。广义的食品生化技术包括在食品加工制造上的所有生物技术，涉及到基因工程（是生物技术的核心与基础）、细胞工程、发酵工程、酶工程以及生物工程下游技术（包括提取和纯化技术等）和现代分子检测技术。食品生物技术涵盖分子生物学、细胞生物学、免疫学、生理学、遗传学、生物化学、微生物学、生物物理学、食品营养学、毒理学等生物类学科，同时涉及信息学、电子学、化学等学科，是一门多学科相互渗透的综合性学科。
现代生物技术的迅猛发展,成就非凡,推动着科学的进步,促进着经济的发展,改变着人类的生活与思维,影响着人类社会的发展进程。现代生物技术的成果越来越广泛地应用于医药、食品、能源、化工、轻工和环境保护等诸多领域。生物技术是21世纪高新技术革命的核心内容,具有巨大的经济效益及潜在的生产力。专家预测,到2010～2020年,生物技术产业将逐步成为世界经济体系的支柱产业之一。
发酵工程是指采用现代工程技术手段，利用微生物的某些特定功能，为人类生产有用的产品，或直接把微生物应用于工业生产过程的一种新技术。发酵工程的内容包括菌种的选育、培养基的配制、灭菌、扩大培养和接种、发酵过程和产品的分离提纯等方面。
二、食品生化技术在发酵工业的应用
（一）、基因技术在食品发酵工程中的应用
基因技术在现代生化技术中占有重要的地位,主要采用类似工程设计的方法,按照不同的需求将目的基因剪切、组合、拼接,再将人工重组的基因通过载体导入受体细胞,进行无性繁殖,并使目的基因在受体细胞中高速发展,产生出人类所需要的产品或组建成新的生物类型。基因技术在食品发酵工程中主要有以下应用:
1、改良酿酒酵母菌的性能
利用基因工程技术培育出新的酿酒酵母菌株,用以改进传统的酿酒工艺,并使之多样化。采用基因工程技术将大麦中的淀粉酶基因转入啤酒酵母中后,即可直接利用淀粉发酵,使生产流程缩短,工序简化,革新啤酒生产工艺。目前,已成功地选育出分解β-葡聚糖和分解糊精的啤酒酵母菌株、嗜杀啤酒酵母菌株,提高生香物质含量的啤酒酵母菌株。
2、改良面包酵母菌的性能
将优良酶基因转入面包酵母菌中后,其含有的麦芽糖透性酶及麦芽糖的含量比普通面包酵母显著提高,面包加工中产生二氧化碳气体量提高,应用改良后的酵母菌种可生产出膨润松软的面包。
3、 改良乳酸菌发酵剂的性能
乳酸菌能代谢产生乳酸,降低发酵产品pH值。乳酸菌基因表达系统分为组成型表达和受控表达两种类型,其中受控表达系统包括糖诱导系统、Nisin诱导系统、pH 诱导系统和噬菌体衍生系统。相对于乳酸乳球菌和嗜热链球菌而言,德氏乳杆菌的基因研究比较缺乏,但是已经发现质粒pN42和PJBL2用于构建德氏乳杆菌的克隆载体。有研究发现乳酸菌基因突变有2种方法:第一种方法涉及(同源或异源的)可独立复制的转座子,第二种方法是依赖于克隆的基因组DNA 片断和染色体上的同源部位的重组整合而获得。通过基因工程得到的乳酸菌发酵剂具有优良的发酵性能,产双乙酰能力、蛋白水解能力、胞外多糖的稳定形成能力、抗杂菌和病原菌的能力较强。
（二）细胞工程技术在食品发酵生产中的应用
细胞工程是生物工程主要组成之一,出现于20世纪70年代末至80 年代初,是在细胞水平上改变细胞的遗传特性或通过大规模细胞培养以获得人们所需物质的技术过程。细胞工程主要有细胞培养、细胞融合及细胞代谢物的生产等。细胞融合是在外力(诱导剂或促融剂)作用下,使两个或两个以上的异源(种、属间) 细胞或原生质体相互接触,从而发生膜融合、胞质融合和核融合并形成杂种细胞的现象。细胞融合技术是一种改良微生物发酵菌种的有效方法,主要用于改良微生物菌种特性、提高目的产物的产量、使菌种获得新的性状、合成新产物等。与基因工程技术结合,使对遗传物质进一步修饰提供了多样的可能性。例如日本味之素公司应用细胞融合技术使产生氨基酸的短杆菌杂交,获得比原产量高3倍的赖氨酸产生菌和苏氨酸高产新菌株。酿酒酵母和糖化酵母的种间杂交,分离子后代中个别菌株具有糖化和发酵的双重能力。日本国税厅酿造试验所用该技术获得了优良的高性能谢利酵母来酿制西班牙谢利白葡萄酒获得了成功。目前,微生物细胞融合的对象已扩展到酵母、霉菌、细菌、放线菌等多种微生物的种间以至属间,不断培育出用于各种领域的新菌种。
（三）酶在食品发酵生产中的应用
酶是活细胞产生的具有高效催化功能、高度专一性和高度受控性的一类特殊生物催化剂。酶工程是现代生物技术的一个重要组成部分,酶工程又称酶反应技术,是在一定的生物反应器内,利用生物酶作为催化剂,使某些物质定向转化的工艺技术,包括酶的研制与生产,酶和细胞或细胞器的固定化技术,酶分子的修饰改造,以及生物传感器等。酶工程技术在发酵生产中主要用于两个方面,一是用酶技术处理发酵原料,有利于发酵过程的进行。如啤酒酿制过程,主要原料麦芽的质量欠佳或大麦、大米等辅助原料使用量较大时,会造成淀粉酶、俘一葡聚糖酶、纤维素酶的活力不足,使糖化不充分、蛋白质降解不足,从而减慢发酵速度,影响啤酒的风味和收率。使用微生物淀粉酶、蛋白酶、一葡聚糖酶等制剂,可补充麦芽中酶活力不足的缺陷,提高麦汁的可发酵度和麦汁糖化的组分,缩短糖化时间,减少麦皮中色素、单宁等不良杂质在糖化过程中浸出,从而降低麦汁色泽。二是用酶来处理发酵菌种的代谢产物,缩短发酵过程,促进发酵风味的形成。啤酒中的双乙酰是影响啤酒风味的主要因素,是判断啤酒成熟的主要指标。当啤酒中双乙酰的浓度超过阈值时,就会产生一种不愉快的馊酸味。双乙酰是由酵母繁殖时生成的α-乙酰乳酸和α-乙酰羟基丁酸氧化脱羧而成的,一般在啤酒发酵后期还原双乙酰需要约5～10d 的时间。崔进梅等报道,发酵罐中加入α-乙酰乳酸脱羧酶能催化α-乙酰乳酸直接形成羧基丁酮,可缩短发酵周期,减少双乙酰含量。
三、小结
应用生物技术可以提高发酵剂的性能,缩短发酵周期,丰富发酵制品的种类。不仅提高了产品档次和附加值,生产出符合不同消费者需要的保健制品,而且在有利于加速食品加工业的发展。随着生化技术的日益发展,相信会开发出更多物美价廉的发酵制品,使生物加工技术在食品发酵工业中的应用更加广泛。
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CC.ATP含有两个高能磷酸键，腺嘌呤核糖核苷酸含有一个高能磷酸键，mRNA无高能磷酸键DD.腺嘌呤核糖核苷酸是mRNA的单体之一，ATP去掉远离腺苷的两个磷酸基团后的剩余部分就是腺嘌呤核糖核苷酸分值: 6分 查看题目解析 >22.下列关于细胞结构和功能的叙述错误的是()AT2噬菌体的外壳在宿主细胞的核糖体上合成B生态系统的生产者的细胞中均无中心体C线粒体内膜上和类囊体膜上均附着催化ATP合成酶D细胞核是细胞的代谢中心，但并非所有细胞中都有细胞核分值: 6分 查看题目解析 >33.在蛋白质合成过程中，肽酰转移酶催化核糖体上一个氨基酸的氨基与另一个氨基酸的羧基间形成肽键。该酶对核糖核酸酶敏感，但对蛋白酶不敏感。下列关于肽酰转移酶的叙述错误的是（）A肽酰转移酶在核糖体上合成
B肽酰转移酶在核糖体中起作用C肽酰转移酶催化氨基酸脱水缩合D肽酰转移酶能降低反应的活化能分值: 6分 查看题目解析 >44.下列对某二倍体生物（2n=16）中进行的正常的减数分裂过程的叙述，错误的是()A间期结束时细胞中的核DNA数目增加一倍B姐妹染色单体消失时的细胞中不存在同源染色体
C分裂过程中一定出现同源染色体的分离D分裂过程中可能会出现姐妹染色单体之间的交叉互换分值: 6分 查看题目解析 >55.研究人员在豌豆的细胞中发现了如下图所示的4种变异类型，下列有关说法正确的是()
A甲、乙、丁均属于染色体结构变异
B甲、乙、丙均展示了联会时期的染色体形态特征C若不考虑其他染色体，乙、丙经减数分裂最多均能形成2种配子D变异甲、乙、丙并没有改变基因的种类与数量，因此不会导致生物性状改变分值: 6分 查看题目解析 >66.生物学是一门实验科学，下列关于实验①②③④的说法中，正确的是（）①探究低温对植物染色体数目变异的影响 ②用高倍镜观察叶绿体和线粒体③观察根尖分生组织细胞的有丝分裂 ④观察DNA和RNA在细胞中的分布A上述4个实验都用到光学显微镜B实验②④中，都用甲基绿作为染色剂，且甲基绿为活性染色剂C实验①③均可使用体积分数为95%的酒精，只是实验①在使用时还需加入适量的无水碳酸钠出去酒精中的水分D实验③④均用到了盐酸，其作用是改变细胞膜的通透性，加速染色剂进入细胞，同时使染色体中的DNA和蛋白质分离，有利于染色分值: 6分 查看题目解析 >简答题（综合题） 本大题共69分。简答应写出文字说明、证明过程或演算步骤。7已知K+有增强植物体对糖类等有机物运输的能力。为探究无土栽培油菜的光合作用的最适K+浓度和最适温度，某同学在温室中做了以下5组实验，除表格所给条件外，其他条件均适宜。于中午12:30测定各组叶片的光合速率，各组实验处理及结果如下表所示：
（注：每组实验均重复10次，实验数据求平均值）回答下列问题：29.为探究无土栽培油菜光合作用的最适K+浓度，该实验的无关变量有 （写出3个）。30.最适浓度的K+，可以 ，从而提高光合速率。31.根据上述实验结果，能否判断无土栽培油菜光合作用的最适K+浓度？为什么？32.根据上述实验结果，能否判断无土栽培油菜光合作用的最适温度？为什么？分值: 12分 查看题目解析 >8科学实验证实，抽取人体扁桃体中的干细胞可以用来修复受损的肝脏器官。请回答下列问题：
33.人体扁桃体干细胞中有23对同源染色体，甲图表示干细胞修复受损的肝脏器官的过程中，细胞中某种物质随时间的变化曲线，请写出甲图的纵坐标代表的内容 。34.受损的肝脏细胞中存在部分死亡细胞，其中因肝脏受损导致细胞的死亡称 ，而被病原体感染的细胞被效应T细胞攻击的死亡称 。35.干细胞内不存在转氨酶（肝脏细胞内特有）的原因是 。36.图乙a、b、c中表示染色单体的是 ，理由是 。分值: 7分 查看题目解析 >9豌豆的抗病对感病为显性，高茎对矮茎为显性，两对性状独立遗传。现有天然感病矮茎和抗病高茎两品种的豌豆种子，欲培育纯合的抗病矮茎品种。请回答：37.若采用杂交育种的方法培育抗病矮茎新品种，需对母本进行 （写出3种操作）等处理，以进行人工杂交．杂交育种所依据的遗传学原理是，其过程可通过将上述两个亲本杂交，在F2中选择表现型为 的个体，再经连续自交和 等手段，最后得到稳定遗传的抗病矮茎新品种。38.采用诱变育种的方法也可以获得纯合的抗病矮茎品种。在用γ射线诱变时，需要处理大量种子，其原因是基因突变具有 、 等特点。39.若采用单倍体育种，需采用 方法获得单倍体植株，然后用人工诱导的方法处理单倍体幼苗，使 。单倍体育种涉及的原理主要有 。其优点是 ，且获得的二倍体为 。分值: 10分 查看题目解析 >10在一群羽毛为蓝色的鸟中，偶然发现一只灰红色羽的雌鸟，欲探究该种鸟羽毛眼色的遗传方式，实验设计如下，用该灰红色羽雌鸟与蓝色羽雄鸟。（已知鸟类的性别决定为ZW型，即ZZ表现为雄性，ZW表现为雌性）40.若F1的性状表现为灰红色羽：蓝色羽=1:1，且雌鸟、雄鸟个体中两种性状均有，则此突变基因位于是 （常、Z、W）染色体上，亲本灰红色羽雌鸟的变异类型是 （显性、隐性）基因突变。41.若F1的性状表现为灰红色羽雄鸟：蓝色羽雌鸟=1:1，则此突变基因位于是 （常、Z、W）染色体上，亲本灰红色羽雌鸟的变异类型是 （显性、隐性）基因突变。此条件下， （能，不能）通过杂交实验判断突变基因所在染色体的同源染色体上是否含有控制羽毛颜色的基因，原因是 。42.若F1的性状表现为灰红色羽雌鸟：蓝色羽雄鸟=1:1，则此突变基因位于是 （常、Z、W）染色体上，亲本灰红色羽雌鸟的变异类型是 （显性、隐性）基因突变。分值: 10分 查看题目解析 >11某些微生物能合成纤维素酶，通过对这些微生物的研究，人们能够利用秸秆等废弃物生产酒精，用纤维素酶处理服装面料等。研究人员用化合物A、硝酸盐、磷酸盐以及微量元素配置的培养基，成功地筛选到能产生纤维素酶的微生物。请分析并回答问题：43.培养基中加入的化合物A是 ，为微生物的生长提供碳源，这种培养基属于 培养基，配置培养基过程中常用的灭菌法为 。44.在筛选纤维素分解菌的过程中，通常用 染色法，如果培养基某部位出现 现象则说明存在纤维素分解菌。45.一同学在纯化该类生物时，发现涂布的培养基上菌落连成一片，最可能的原因是 ，应该采取 措施避免出现此现象。46.实验结束后，使用过的培养基应该进行 处理后才能倒掉，这样做的目的是保护环境（防止污染环境）。分值: 15分 查看题目解析 >12【生物-选修3：现代生物科技专题】已知pUC质粒上携带有IacZ+基因的一段序列，编码β-半乳糖苷酶的α肽。而宿主细胞含有IacZ+的突变基因，其产物无β-半乳糖苷酶活性，但遇α肽，可发生α-互补作用，产生有活性的酶，使培养基中的无色物质X-Gal分解，菌落呈蓝色；若将外源基因插入到质粒上IacZ+序列中，失去α-互补作用（注：宿主细胞菌落为白色）。图甲为pUC质粒表达载体简图，小箭头所指分别为限制性内切酶EcoRI、BamHI的酶切位点，tctR为四环素抗性基因，P为启动子、T为终止子，ori为复制原点。图乙表示目的基因的两端分别有EcoRI、BamHI在内的多种酶的酶切位点。为获得目的菌株，请分析回答下列问题：
47.为快速筛选目的基因，应将含有目的基因的DNA与pUC质粒表达载体分别用 酶切，酶切产物用 进行连接后将得到的混合物直接导入受体菌中，培养受体菌有的未被转化（用A表示），有的被转化，被转化的菌株有三种（B含环化目的基因的菌株 C含质粒载体的菌株 D含插入了目的基因的重组质粒的菌株）。48.为筛选出插入了目的基因的菌株，需要将宿主细胞接种在含有 的培养基中。49.在培养基中，不能生长的菌株为 ；产生蓝色菌落的菌株为 ；产生白色菌落的菌株为 （请用（1）中的A、B、C、D字母作答）。50.基因工程中除质粒作为基因载体外，还可用动植物病毒和 。12 第(1)小题正确答案及相关解析正确答案
EcoRⅠ DNA连接酶解析
用上述两种限制酶同时切割目的基因后，目的基因的两个黏性末端不同，这样目的基因就不会自连城环状，同样用上述两种限制酶同时切割质粒后，质粒的两个黏性某端也不同，这样质粒也不会自连，这样当把切割后目的基因和切割后质粒混合后，只有目的基因和质粒才能相连。为快速筛选目的基因，应将含有目的基因的DNA与pUC质粒表达载体分别用EcoRⅠ酶切，酶切产物用DNA连接酶进行连接后将得到的混合物直接导入受体菌中。考查方向
意在考查考生能从材料中获取基因工程原理的生物学信息，并能运用这些信息，结合所学知识解决相关的生物学问题的能力。解题思路
结合知识分析题干完成易错点
内切酶12 第(2)小题正确答案及相关解析正确答案
（无色物质）X-Gal和四环素（3，写不全0分）解析
由题意可知，“宿主细胞含有IacZ+的突变基因，其产物无β-半乳糖苷酶活性，但遇α肽，可发生α-互补作用，产生有活性的酶，使培养基中的无色物质X-Gal分解，菌落呈蓝色”，因此为筛选出插入了目的基因的菌株，需要将宿主细胞接种在含有（无色物质）X-Gal和四环素的培养基中，观察菌落是否是白色。考查方向
意在考查考生能从材料中获取相关的生物学信息，并能运用这些信息，结合所学知识解决相关的生物学问题的能力。解题思路
结合知识分析题干完成易错点
材料分析12 第(3)小题正确答案及相关解析正确答案
A、B C D解析
由于培养基中加入四环素，因此不含抗性基因的细菌不能生长，即在培养基中，不能生长的菌株为A、B；C含质粒载体的菌株由于没有插入目的基因，因此产生蓝色菌落；若将外源基因插入到质粒上IacZ+序列中，失去α-互补作用，D含插入了目的基因的重组质粒的菌株会导致产生白色菌落。考查方向
意在考查考生能从材料中获取相关的生物学信息，并能运用这些信息，结合所学知识解决相关的生物学问题的能力。解题思路
结合知识分析题干完成易错点
材料分析12 第(4)小题正确答案及相关解析正确答案
λ噬菌体衍生物解析
基因工程中除质粒作为基因载体外，还可用动植物病毒和λ噬菌体衍生物。考查方向
本题主要考查了基因工程的相关知识,意在考查考生能理解所学知识的要点，把握知识间的内在联系，形成知识的网络结构的能力。解题思路
A. 植物体杂交具有克服远缘杂交不亲和障碍的优点
B. 杂交瘤细胞和骨髓瘤细胞可以在一个培养瓶中无限增殖
C. 植物细胞产物包括蛋白质、脂肪、药物、香料、生物碱等
D. 试管动物培育过程涉及到动物细胞核移植和胚胎移植等技术
2. 培育“试管山羊”的基本过程如下图所示，有关叙述正确的是（ ）
A. 可以取早期胚胎（如桑葚胚、囊胚）进行分割以增加胚胎的数量
B. 图中刚采集的新鲜应当放在保温瓶中（生理盐水）存放
C. 乙表示受精作用，该过程在输卵管中进行
D. 对供、受体母牛进行同情处理来维持其相同的生理环境，这为胚胎的收集提供可能
3. 以下对于胚胎工程的说法错误的是（ ）
A. 胚胎工程是指对动物早期胚胎或配子所进行的多种显微操作和处理技术
B. 胚胎干细胞具有体积小，细胞核大和蛋白质合成旺盛等特点
C. 早期胚胎培养与动物细胞培养的培养液通常都需加入血清
D. 胚胎移植的主要意义是可充分发挥雌性受体的繁殖能力，缩短繁殖周期，增加一生繁殖的后代数量
4. 假设a、B为玉米的优良基因，现有AABB、aabb两个品种，控制两对相对性状的基因位于两对同源染色体上，实验小组用不同方法进行了实验（见右图），下列说法不正确的是（ ）
A. 过程①育种方法的原理是基因突变，最大优点是能提高突变率，在短时间内获得更多的优良变异类型
B. 过程②③④育种方法的原理是基因重组，基因型aaB_的类型经④后，子代中aaBB所占比例是5/6
C. 过程⑤通常使用秋水仙素，它可抑制细胞分裂时纺锤体的形成
D. 过程⑥⑦应用了单倍体育种的方法，最大的优点是明显缩短育种年限
5. 下图分别表示对几种生物体内正在进行分裂的细胞进行观察的结果，有关假设推论正确的是（ ）
c 染色单体][a组][b组][c组][染色体数][a b c][O][4N][2N][O][细胞相对数目] [细胞中的含量]
A. 若甲图为有丝分裂过程中的某阶段，则下一时期细胞中央将出现赤道板
B. 若图乙表示有丝分裂过程中的某阶段，则染色体着丝点分裂可发生在这一阶段
C. 若图乙表示减数分裂过程中的某阶段，则同源染色体的分离可发生在这一阶段
D. 若图丙表示雄果蝇精巢内的几种细胞，则C组细胞中可能出现联会和四分体
6. 下列关于基因工程应用的叙述，正确的是（ ）
A. 运用基因工程技术，把有缺陷的基因切除，达到治疗疾病的目的
B. 基因诊断的基本原理是DNA分子杂交
C. 一种基因探针能检测水体中的各种病毒
D. 原核生物基因不能用来进行真核生物的遗传改良
7. 下列说法正确的是（ ）
A. 质粒是广泛存在于细菌细胞中的一种颗粒状细胞器
B. 用适当的化学物质处理受体细菌表面，将重组DNA导入受体细菌
C. 质粒是基因工程中惟一用作运载目的基因的运载体
D. 利用运载体在宿主细胞内对目的基因进行大量复制的过程不能称为“克隆”
8. 苏云金芽孢杆菌的抗虫基因之所以能在棉花的细胞中准确地表达出来，主要是因为（ ）
A. 目的基因能在植物细胞核中进行复制
B. 目的基因与棉花DNA的基本结构相同
C. 不同生物共用一套遗传密码
D. 不同生物具有相同的一套遗传信息
9. 下图为人工培养的肝细胞中DNA含量随时间变化曲线，培养中所有细胞都处于细胞周期的同一阶段。以下分析正确的是（ ）
A. 人工培养肝细胞的细胞周期是14小时
B. AB段主要变化是通过转录合成mRNA
C. 在BC段细胞内可能会发生基因重组
D. DE段有合成蛋白质的翻译过程发生
10. 下列有关生物学实验的叙述中，正确的是（ ）
A. 在观察根尖分生组织细胞的有丝分裂实验中，将解离、漂洗、染色的洋葱根尖置于载玻片上，盖上盖玻片即可在显微镜下观察
B. 在低温诱导植物染色体数目的变化的实验中，剪取诱导处理的根尖，立即放入解离液中解离，然后漂洗、染色、制片
C. 观察线粒体，用新鲜的藓类叶代替口腔上皮细胞，效果较佳
D. 选用紫色洋葱鳞片叶表皮细胞观察到质壁分离现象时，观察不到染色体
11. 人类寄希望于利用干细胞（人体中具有分裂、分化能力的细胞）的分离和体外培养，在体外培育出组织器官，并最终通过组织或器官移植实现对临床疾病的治疗。能否用肌细胞代替干细胞（ ）
A. 不能，因为肌细胞与干细胞所含有的遗传物质不同
B. 能，因为肌细胞虽然是分化的细胞，但在一定条件下也可脱分化，实现细胞全能性
C. 不能，因为肌细胞是高度分化的细胞，没有分裂能力
D. 能，因为肌细胞与干细胞具有完全相同的遗传物质
12. 关于桑椹胚和囊胚的比较，以下说法不正确的是（ ）
A. 囊胚期细胞分化是由于遗传物质突变引起的
B. 囊胚期的细胞出现了细胞分化，但遗传物质未发生改变
C. 桑椹胚的各细胞结构功能基本相同
D. 囊胚期内细胞团和滋养层细胞差异不是复制水平的差异，而是转录水平上的差异
13. 某种转基因玉米能高效合成一种多肽类的蛋白质酶抑制剂，积累于茎中，让取食它的害虫的消化酶受抑制，无法消化食物而死。下列就该玉米对人类的安全性评论中，不符合生物学原理的是（ ）
A. 安全，玉米的蛋白酶抑制剂对人体的消化酶很可能无影响，因为人体消化酶和害虫消化酶结构上存在差异
B. 安全，人类通常食用煮熟的玉米食品，玉米的蛋白酶抑制剂已被高温破坏，不抑制人体消化酶
C. 不安全，玉米的食用部分也可能含有蛋白酶抑制剂，食用后使人无法消化蛋白质而患病
D. 不安全，玉米的蛋白酶抑制剂基因可通过食物链在人体细胞内表达，使人无法消化食物而患病
14. 目前，欧洲、亚洲许多国家都发现了禽流感疫情，并引起了人体感染，造成多人死亡。科学工作者经研究，发现了数种快速检验禽流感病原体的方法，以正确诊断禽流感，以下有关禽流感病原体研究、诊断的叙述错误的是（ ）
A. 镜检法：在光学显微镜下直接观察病人的痰液或血液，以发现病原体
B. PCR：体外基因复制技术，可在几十分钟内把病原体的基因扩展到数百万倍
C. 用特殊制备的病原体蛋白质与病人血清中的相关抗体特异性结合，以发现病原体
D. DNA探针技术：用放射性同位素、荧光分子等标记的DNA 分子做探针，利用DNA分子杂交原理来检测病原体
15. 测定3类细菌对氧的需要，让它们在3个不同的试管中生长，下图显示了细菌的生长层。据此判断：只能在需氧培养基中繁殖、只能在无氧培养基中繁殖、在有氧和无氧的培养基中都能繁殖的细菌依次是（ ）
16. 聚合酶链式反应（PCR技术）是体外酶促合成特异DN段的一种方法，由高温变性、低温退火及适温延伸等几步反应组成一个周期，循环进行，使目的DNA得以迅速扩增，其简要过程如右图所示。下列关于PCR技术叙述不正确的是（ ）
A. PCR技术是在实验室中以少量DNA制备大量DNA的技术
B. 反应中新合成的DNA又可作为下一轮反应的模板
C. PCR技术以核糖核苷酸为原料，以指数方式扩增
D. 应用PCR技术与探针杂交技术可以检测基因突变
17. 花粉管通道法是指利用植物受精后花粉萌发形成的花粉管通道，将目的基因导入尚不具备细胞壁的合子，形成含有目的基因的胚。经培养、筛选，可获得有特定性状的转基因植株。下列有关说法中不正确的是（ ）
A. 为了减少盲目性，可以通过人工合成的途径来获得目的基因
B. 目的基因导入受体细胞后，通过植物组织培养才能获得相应的植株
C. 所得转基因植株个体发育的起点是受精卵，形成该植株时无脱分化过程
D. 将目的基因导入叶绿体DNA中，可避免目的基因通过花粉传递而造成“基因污染”
18. “塑化剂”“口蹄疫”“疯牛病”“艾滋病”是全世界关注的问题，下列说法错误的是（ ）
A. 口蹄疫疾病是由口蹄疫病毒感染有蹄类动物（如猪、牛等）的一种高传染性疾病，人致病的机会很少
B. 2011年台湾爆发的“塑化剂”食品污染事件，是一种病毒引起的污染
C. 艾滋病病毒能破坏人体的免疫系统，最终使人失去免疫能力而丧命
D. 疯牛病是疯牛病病毒感染牛引起的脑疾病，人类食用疯牛病病牛制成的食品，会感染脑病变的致命疾病
19. 将无根的非洲菊幼苗转入无植物激素的培养基中培养，在适宜的温度和光照等条件下培养一段时间后，应出现的现象是（ ）
20. “筛选”是生物工程中常用的技术手段，下列关于筛选的叙述中不正确的是（ ）
A. 重组质粒上的标记基因的作用是鉴别受体细胞中是否含有目的基因，从而将含有目的基因的细胞筛选出来
B. 单克隆抗体制备过程中，在完成细胞融合后，第一次筛选的目的是从不同种类的细胞中筛选出杂交瘤细胞
C. 单克隆抗体制备过程中，在完成细胞融合后，第二次筛选的目的是筛选出针对目标抗原的抗体为阳性的杂交瘤细胞
D. 基因工程中用不同种限制性核酸内切酶切割运载体和目的基因，酶切产物用DNA连接酶连接，将获得的产物直接导入受体细胞
21. 如图为洋葱根尖有丝分裂的图像（甲）和有丝分裂过程中DNA数量变化曲线图（乙），其中A、B、C、D、E为细胞代号，请据图回答：
（1）根据细胞周期写出甲图中所示细胞在有丝分裂中的顺序 。
（2）甲图中B细胞处于 期，其主要特点是染色体的 排列在细胞中央赤道板上。
（3）在乙图中ab时间段内细胞发生的主要变化是 ，这个变化出现在甲图的细胞 中（用图中代号表示）。
（4）乙图中bc时间段表示细胞分裂的 期。
（5）请在乙图中相应的位置上画出染色体数量变化曲线。
（1）癌细胞的两个重要特点是 、 。
（2）过程②③合称为 。
（3）图中②过程中，主要需要 酶，其作用是 。
（4）根据图中的信息，从信息交流的角度提出一种抑制癌细胞产生的方法 。
23. 下图表示干细胞的三个发育途径。据图回答下列问题：
（1）由A细胞形成的B细胞仍然保持着其特有的 和 能力，A细胞到C细胞的过程是由 控制的。
（2）由A细胞到形成多个卵细胞的过程，则必须经过 和减数分裂。
（3）若D细胞是胰腺细胞，则结构⑦所起的作用是 。
关键词：转基因水稻;定性检测;启动子;终止子;Bt基因;多重PCR;Real-time PCR
中图分类号：Q78;S511 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2015）02-0262-04
DOI：10.14088/ki.issn0439-8114.2015.02.002
Problems and Strategies Qualitatively Detecting Genetically-modified Rice with Multiplex PCR and Real-time PCR
QIU Juan
（Food Crops Research Institute，Hubei Academy of Agricultural Sciences，Wuhan 430064，China）
Abstract： As genetically-modified（GM） rice will be commercialized， qualitatively detecting GM rice becomes more and more important. Based authors’ practice in detecting of transgenic Bt rice with the quality standard of Chinese Ministry of Agriculture， the potential problems were analyzed from technical level and theoretical perspective. The detection of transgenic components （promoter， terminator， reference gene and target gene etc） of GM rice with PCR was discussed. The possible solutions were proposed from the principles of plant virology and genetic engineering based on previous reports.
Key words：genetically-modified（GM） rice;qualitative detection;promoter;terminator;Bt gene;multiplex PCR;real-time PCR
转基因技术应用于作物以来，转基因产品如玉米、大豆、棉花等都已有商业化的品种问世;目前在世界上使用最多的转基因商业化基因是抗除草剂基因和Bt杀虫基因。而水稻作为一种主粮，商业化步伐远远慢于这几种作物;目前最有可能商业化的转Bt杀虫基因的是中国与国际水稻所合作研制的“华恢1号”、“Bt汕优63”和欧洲研制的富含维生素A的Golden rice[1，2]。
自从国家给转基因水稻发放了安全证书，转基因水稻的商业化成为了热门的议题。目前农业部发放安全证书的转基因水稻有抗虫转基因水稻“华恢1号”和“Bt汕优63”，国家制定了关于作物和转基因水稻的检测方法标准[1，3]。国家质量检测部门有完善的种子和食品检测系统，来定性检测是否含有转基因成分。但是随着转基因水稻即将大规模的种植，科研人员在研究和育种过程也有大量的样品需要检测，主要目的有以下几个：①更好地进行常规品种转基因育种工作，防止转基因的品种污染常规品种，保持种质的纯合，同时检测转基因的水稻在田间有没有发生漂移;②节省人力物力，大量的水稻样品送到专门的质检部门检测价格昂贵;③有些检测样品中的转基因成分元件，是超出国家质量标准检测范围的。
转基因作物和转基因食品的检测方法有很多，例如PCR、Southern Blot、基因芯片等[4-7]。常规和便捷的方法是普通PCR以及由其衍生出的半定量PCR方法[8，9];在国内外使用的最多定性作用更强的是Real-time PCR[10-12]。多重PCR检测方法被广泛使用[4]。本文根据自己的一些实践，总结出了在食品检验、科研或者育种工作中进行多重PCR检测分析转基因样品中的几个要点。
1 污染源的杜绝
转基因检测中，只有杜绝一切污染源，才有可能在后续的检测中做出正确的判断。如果没有做好防止污染，很容易出现假阴性和假阳性。因此所有的试剂须新鲜现配、灭菌，枪头、离心管等要严格灭菌，玻璃器皿需要清洗干净[13]。样品必须防止交叉污染，条件允许的话，可以进口高质量的离心管、枪头等，以便在后续的试验中起到排除污染的作用[12]。
2 样品DNA的提取方法
DNA的提取方法既可以采用经典的CTAB方法，也可以按照农业部的质检标准书的方法，这两种方法用于PCR和半定量PCR、Real-time荧光定量PCR都有很好的结果[3，14];条件允许的话，也可以采用试剂盒。有学者采用快速提取法获得的转基因番茄DNA，用于Real-time PCR检测，取得了很好的结果;鉴于这一点，快速方法提取的转基因水稻DNA，也应该可以适用于Real-time PCR的检测，这就为检测大量的水稻DNA样品提供了便捷的途径[3，15-17]。Cankar等[18]、Demeke等[19]在水稻转基因检测的实践中，采取适用于RFLP分子标记检测的水稻DNA快速提取法，取得了比较好的效果。
3 转基因水稻的多重PCR检测
根据农业部的质检标准书，采用的是多重PCR和Real-time PCR的方法。在转基因的检测中，有4个检测元件：启动子、终止子、靶基因、内参基因。转基因的定性检测中，首先要检测的是内参基因，因为内参基因能确定DNA模板的质量;然后是检测启动子和终止子，在检测出启动子或者终止子以后，还要进一步检测靶基因。只有两个以上的转基因元件被检测出，才能定性为转基因的水稻[3，4，9，20]。
3.1 内参基因的检测
在定性检测转基因水稻中，会设置内参基因，农业部的质检标准书采用的是水稻sps（蔗糖磷酸合成酶）基因[3，21];也可以采用常规试验中经常用的水稻β-Actin基因的引物（在不同的物种中高度保守，组织和细胞中的表达相对恒定内参基因的检测），可以对模板进行定性为水稻的DNA，同时可以根据PCR产物条带的亮度来确定模板的质量。
3.2 启动子的检测
3.2.1 CaMV 35S启动子的检测 根据农业部制定的质检标准书，在目前的转基因水稻中的定性检测一般检查的是花椰菜病毒35S启动子。早期的水稻转基因多采用这个启动子，这次农业部批准的“Bt汕优63”也是采用的CaMV 35S启动子。
3.2.2 含CaMV 35S启动子的转基因水稻和病毒感染的定性区分 转基因食品中CaMV 35S启动子中有一个关键性问题就是区别转基因与病毒感染和污染[22-24]。在食品的安检和十字花科蔬菜的转基因定性检测中，通常会检测是否有CaMV 35S启动子转基因元件还是被花椰菜病毒感染了[22]。但是在确定没有污染的情况下，检测出35S启动子并不能定性样品含有转基因成分。花椰菜病毒会感染很多十字花科的蔬菜，病毒基因组也会整合到其侵染的植物基因组里面（感染水稻的可能性很小），在这种情况下，可以根据花椰菜病毒的外壳蛋白基因或复制酶基因设计特异性引物，也可以根据被花椰菜病毒感染后的特殊产物设计特异性引物，在转录水平上来定性是含CaMV 35S启动子成分的样品还是被花椰菜病毒感染了[25-31]。在一般情况下，水稻并不是花椰菜病毒的宿主，被感染的可能性不大，因此，这项检测只有在质量检测要求特别严格的情况下会被采用。同时，通过定量荧光Real-time PCR也可以排除样品是被花椰菜病毒感染或者污染还是转基因，具体的方法参见后文关于荧光PCR定量检测的内容[3，10]。
3.2.3 其他启动子 随着转基因技术的不断发展，更多被农业科学家采用的是组织特异性的启动子，例如新一代的转基因水稻就是采用组织特异性表达的启动子[32]。因此，随着转基因水稻品种越来越多，更多种类的启动子检测将会出现在质检标准中[33]。
3.3 终止子的检测
3.3.1 植物基因工程的原理 根癌农杆菌的Ti质粒和发根农杆菌的Ri质粒，其特定部位能与植物的DNA发生整合，因此常被用作植物基因工程中的载体。
3.3.2 Nos终止子 在转基因植物中，常采用Nos终止子来构建载体，“华恢1号”和“Bt汕优63”也是采用的Nos终止子， 因此可以按照农业部的质检标准书用PCR定性检测Nos终止子[3，34]。Nos终止子是农杆菌菌株Ti质粒的T-DNA上的胭脂碱合成酶的终止子。胭脂碱属于冠瘿碱，在与植物共生或者转化植物以后，会释放出对植物有害的毒素，因此在Ti质粒上构建载体的过程中，会剪切掉这个基因，但是会保留这个基因的终止子（Nos），并通常用这个Nos终止子作为转基因的终止子[35]。
3.3.3 其他终止子 植物转基因的构建方法表明，转基因载体基本采用的是农杆菌T-DNA上的冠瘿碱的终止子。农杆菌的不同菌株含有不同Ti质粒，其包含的T-DNA上的冠瘿碱也不同。例如，农杆菌菌株LBA4404的毒性区来自章鱼碱型质粒，农杆菌菌株GV3101的毒性区来自胭脂碱型质粒，农杆菌菌株EA101、EA105的毒性区来自琥珀碱型质粒。冠瘿碱有4种类型：章鱼碱（Octopine）、胭脂碱（Nopaline）、农杆碱（Agropine）、琥珀碱（Succinamopine），其终止子分别为 Ocs、Nos、Ags、Sus。在基因工程上最常用的是上面提到的胭脂碱型质粒和它的Nos终止子，其次就是章鱼碱型质粒和它的Ocs终止子[36-38]。因此在转基因的定性检测中，可以根据每个实验室采用的质粒和构建方法的不同，设计别的终止子引物，例如Ocs终止子的引物[35]。
3.4 靶基因的检测
最近中国颁发安全证书的“Bt汕优63”和“华恢1号”都是转基因抗虫水稻，是高抗鳞翅目害虫转基因水稻品系;含有Bt融合型杀虫蛋白基因Cry1Ac/Cry1Ab[1]。对这两种转基因水稻的检测，需要根据Bt融合杀虫蛋白的基因来设计引物。
随着越来越多的转基因水稻将要获批准上市，农业科研单位在种质创新和科研中的需要，会有更多的农用基因在检测中出现[33]。
3.5 标记基因的检测
在转基因水稻中常会含有GUS基因、抗生素基因、除草剂等标记基因，因此也可以对这些转基因元件进行检测;但是随着转基因技术的发展，在现阶段转基因育种中，标记基因在后期的工作中通常用共转化等方法被剔除掉，这样剔除了标记基因的品种才更安全，才会用于商业化[39，40]。因此，标记基因的检测在早期的转基因筛选检测中会用到，但是在后期的育种鉴定一般不会采用。不过也可以用在转基因的后期工作中，鉴定品种是否进一步剔除了标记基因。
4 模板和引物
根据农业部的质检标准书，采用的是含有“Bt汕优63”或“华恢1号”的DNA作为阳性模板，并采用CaMV 35S启动子、Nos终止子、Bt融合蛋白基因和内参基因来检测样品;阳性模板应该为单拷贝插入，这样将便于在定量荧光PCR的分析。
由于样品的不确定性，在进行上述检测以外，还可以采用别的模板和引物来检测可能出现的其他种类的转基因元件。例如Ocs终止子、抗除草剂基因、花椰菜病毒的基因、韧皮部特异性表达启动子等。如果没有现成的水稻DNA模板，含有这些元件基因的质粒也可以被选作模板，在做PCR的过程中，要根据试剂盒中的说明，水稻模板DNA和质粒DNA要选择不同的终浓度[41，42]。引物要送到技术质量好的公司合成，模板要保证质量和选择的正确性，防止反应出现假阴性、假阳性。
5 转基因产品的定量Real-time PCR的定性分析作用
转基因中的定量实时荧光PCR是为普通PCR做补充的。由于转基因的普通PCR检测灵敏度达到0.1%[20]， 而且花椰菜病毒的35S启动子非常容易污染检测样品，在没有别的办法排除样品被污染或病毒感染的情况下，实时荧光PCR可以提供非常好的分析数据[3，10，12]。以被含CaMV 35S启动子的外源物污染和被病毒感染的样品为例，分析如下：第一，样品被含有CaMV 35S启动子的外源物污染。这种情况下荧光PCR会检测出35S启动子，但是其丰度会比单拷贝转基因DNA阳性模板的丰度要低;第二，样品被病毒感染。由于病毒一般不会感染植物的每个细胞，因此检测出来的启动子丰度也会比单拷贝转基因的DNA阳性模板要低。因此可以根据定量PCR来区分样品是转基因还是被污染或者被病毒感染了[9，10]。
6 小结
针对这次农业部发放安全证书的两个转基因水稻品种“Bt汕优63”和“华恢1号”的PCR定性检测，可以选取含有启动子CaMV 35S、终止子Nos、含有Bt融合蛋白基因的转基因水稻DNA作为阳性模板，选取非转基因水稻DNA作为阴性模板，对水稻DNA样品进行检测。但这种检测只能定性检测出样品是不是“Bt汕优63”或“华恢1号”，国内外的实验室在转基因生产育种中，还生产了很多其他的转基因水稻品种，采用的转基因元件跟这两个是不完全一样的，甚至完全不一样。对一个未知样品完全定性确定是否为转基因的水稻，还需要多设计出几对引物（其他终止子、启动子、靶基因）进行检测。由于越来越多的转基因品种并非采用的CaMV 35S的启动子，而且这个启动子在检测中很容易受到污染和病毒感染的干扰，因此检测终止子反而更为可靠。现有的报道结果表明，在构建植物基因工程载体中，基本上采用的是农杆菌的T-DNA上的冠瘿碱的终止子（Nos终止子、Ocs终止子），因此，可以根据这些终止子设计引物组，对未知样品进行检测。此外，本研究也可以在实践中摸索出快速提取水稻DNA的方法，提取的DNA质量可以适用于Real-time PCR和半定量常规PCR，可以为大量的转基因水稻样品检验提供便捷。
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