时间：2023-08-31 16:37:23
导语：在生物信息学分析的撰写旅程中，学习并吸收他人佳作的精髓是一条宝贵的路径，好期刊汇集了九篇优秀范文，愿这些内容能够启发您的创作灵感，引领您探索更多的创作可能。
作者简介：李洁（1982—），女，河南商丘人，实验师，主要从事动物遗传育种与繁殖工作。联系电话：（0931）7631225。E-mail：lijie@gsau.edu.cn。
通信作者：王建福（1982—）男，河南商丘人，讲师，主要从事水产养殖工作。联系电话：（0931）7631225。E-mail：wangjf@gsau.edu.cn。
定西市安定区位于甘肃省中部，北纬35°17′54″至36°02′40″，东经104°12′48″至105°01′06″，南北長82.9km，东西宽73.3km，海拔1700～2580m，属典型的黄土高原干旱半干旱雨养农业区，抗旱生产是安定区农业工作的重点。中晚熟玉米适宜海拔在2000m以下的区域种植[1]，而安定区大面积耕地海拔在2000m以上，中晚熟品种很难成熟，全膜双垄沟播技术将玉米种植范围扩大到海拔2100m区域[2-3]。为了考察早熟玉米新品种在安定区高海拔区的适应性、抗逆性、生产稳定性，2017年安定区农业技术推广服务中心引进了7个早熟玉米新品种进行比较试验，以期筛选出适合当地海拔2100m以上区域生产应用的玉米品种。现将结果报道如下。
1材料与方法
1.1供试材料
参试玉米品种7个，其中武科早303、武科早304由武威市武科种业科技有限公司生产，甘玉804由甘肃种业有限责任公司生产，兴达1601、兴达1602由甘肃兴达种业有限公司生产，金穗606、金穗607及当地常规种植品种金穗3号（CK）由白银金穗种业有限公司生产。
1.2试验地概况
试验设在定西市安定区团结镇小山村，海拔2150m，年平均降水量430mm，年蒸发量1450mm，无霜期141d。前茬作物收获后深耕晒垡，冬前浅耕耙耱。采用全膜双垄沟播技术[4]，大垄宽70cm、高10cm，小垄宽40cm、高15cm。覆膜前结合整地一次性基施农家肥45000kg/hm2、玉米专用肥（N-P2O5-K2O为20-15-15）1200kg/hm2。用50%辛硫磷乳油7.5kg/hm2加适量水喷拌细土450kg制成毒土，撒施地面后起垄覆膜以防治地下害虫。用50%乙草胺乳油3750mL/hm2兑水600kg喷洒于垄沟表面芽前除草。
1.3试验方法
试验为随机区组设计，每品种为1个处理，3次重复，小区面积39.6m2（11.0m×3.6m）。4月19日用玉米点播器播种，每穴2粒，播深4cm，行距55cm，株距30cm，密度为60000株/hm2。田间管理措施同当地大田。田间观察记载物候期及主要农艺性状，成熟后按小区抽样考种并单收计产。
2结果与分析
2.1生育期
从表1可以看出，各品种出苗期一致，均在5月2日。金穗607、武科早303、甘玉804、武科早304于6月中旬开始拔节，与金穗3号（CK）基本一致；兴达1601、金穗606、兴达1602拔节期较金穗3号（CK）迟13～16d。抽雄期武科早303、武科早304均为7月11日，较金穗3号（CK）早4d；兴达1602与金穗3号（CK）一致；金穗606、兴达1601、甘玉804较金穗3号（CK）晚2d。成熟期武科早303、武科早304、兴达1602最早，8月下旬已经成熟，较金穗3号（CK）早9d；金穗607、甘玉804、兴达1601、金穗606均在9月上旬与金穗3号（CK）同期成熟。生育期武科早303、武科早304、兴达1602均为117d，较金穗3号（CK）短9d；其他品种生育期为126d，与金穗3号（CK）相同。
2主要性状
由表2可见，株高以金穗607、甘玉804、兴达1601最高，均为2.5m，较金穗3号（CK）高出0.5m；武科早304、金穗606次之，均为2.4m，较金穗3号（CK）高出0.4m；武科早303、兴达1602最低，为1.7m，较金穗3号（CK）低0.3cm。穗位以甘玉804、金穗606最高，为80.0cm，较金穗3号（CK）高12.5cm；金穗607次之，为73.0cm，较金穗3号（CK）高5.5cm；武科早303最低，为36.5cm，较金穗3号（CK）低31.0cm。穗长以兴达1601最长，为23.0cm，较金穗3号（CK）长5.0cm；其次为甘玉804，为21.5cm，较金穗3号（CK）长3.5cm；武科早304最短，为17.5cm，较金穗3号（CK）短0.5cm；其他品种较金穗3号（CK）长0.5～2.0cm。穗粗以金穗606最粗，为15.6cm，较金穗3号（CK）粗0.1cm，其他品种较金穗3号（CK）细0.2～2.3cm。轴粗以武科早304最粗，为10.8cm，较金穗3号（CK）粗0.8cm；其次是金穗606，为10.3cm，较金穗3号（CK）粗0.3cm；其他品种较金穗3号（CK）细0.3～0.7cm。粒型武科早304、兴达1602与金穗3号（CK）一致，均为半马齿型，其余品种均为马齿型。粒色除武科早303、武科早304为黄红色外，其余品种均与金穗3号（CK）一致，为黄色。轴色金穗607、甘玉804、兴达1602为浅粉色；武科早303、兴达1601、金穗606和金穗3号（CK）均为棕红色；武科早304为白色。
2.3产量及构成因子
由表3可知，穗粒数金穗607最多，为630粒，较金穗3号（CK）多132粒；其次是甘玉804，为552粒，较金穗3号（CK）多54粒；其余品种均较金穗3号（CK）少。百粒重以金穗606最高，为31.6g，较金穗3号（CK）高8.2g；其次是武科早303，为28.4g，较金穗3号（CK）高5.0g；武科早304、兴达1601分别为27.7、24.5g，较金穗3号（CK）分别高4.3、1.1g；其余品种均低于金穗3号（CK）。折合产量以武科早304最高，为8737.4kg/hm2，较金穗3号（CK）增产1186.9kg/hm2，增产率为15.7%；其次是武科早303，为8611.1kg/hm2，较金穗3号（CK）增产1060.6kg/hm2，增产率14.0%；金穗607居第3位，折合产量8585.9kg/hm2，较金穗3号（CK）增产13.7%；金穗606为8484.9kg/hm2，较金穗3号（CK）增产12.4%。对产量進行新复极差比较，各品种间产量差异均达到极显著水平。
3小结
在安定区海拔2150m的旱区，对引进的7个玉米品种进行了引种试验。结果表明，参试各玉米品种均可在9月中旬前成熟，武科早304、武科早303、金穗607、金穗606等4个品种综合性状优良。其中武科早304折合产量最高，为8737.4kg/hm2，较对照品种金穗3号增产1186.9kg/hm2，增产率为15.7%；武科早303折合产量8611.1kg/hm2，较对照品种金穗3号增产1060.6kg/hm2，增产率14.0%；金穗607折合产量8585.9kg/hm2，较对照品种金穗3号增产13.7%；金穗606较对照品种金穗3号增产12.4%。
张雷等人[5]认为全膜双垄沟播栽培玉米可在海拔2300m以内的区域内种植。本试验通过对供试玉米品种的性状、生育期及产量结果进行综合分析，建议在安定区海拔2100～2300m区域扩大武科早304、武科早303、金穗607及金穗606的种植面积，其他品种可在海拔2100m以下区域进一步试验。
参考文献：
[1] 刘广才，杨祁峰，李来祥，等. 旱地玉米全膜双垄沟播技术增产效果研究[J]. 农业现代化研究，2009，30（6）：739-743.
[2] 牛建彪. 半干旱区小麦玉米雨水高效利用技术模式[J]. 甘肃农业科技，2005（5）：22-23.
关键词：铁皮石斛，RCA2基因，克隆，生物信息学分析
中图分类号：Q949.71
文献标识码：A
铁皮石斛（Dendrobiumofficinale）属于兰科（Orchidaceae）石斛属（Dendrobium）多年生的草本植物，铁皮石斛含石斛多糖、石斛碱、双苄酚类、菲酚类等多种药效成分，是石斛属药用植物中最为珍稀名贵的种，具有滋阴清热、润肺止咳、益胃生津、明目强身等作用（Zhangetal，2000）。核酮糖1，5二磷酸羧化酶/加氧酶（Ribulose1，5bisphosphatecarboxylase/oxygenase，Rubisco）是存在于叶绿体内的一个双功能酶，同时催化卡尔文循环中最初固定CO2的反应以及光呼吸作用中的第一步反应，该酶处于光合碳还原和碳氧化两个方向相反但又相互关联的循环交叉点上，对净光合速率起着決定性的影响，因此提高Rubisco活力是提高光合作用的重要途径（潘瑞炽等，2004）。因铁皮石斛原生地的生境破坏和常年的滥采乱挖，野生资源遭到严重的破坏，濒临灭绝，已列入中国珍稀濒危保护植物的名录。由于石斛不能够栽培在土壤里，北方地区必须栽培在树皮、木块、锯末等做的栽培床或者是石头上，冬天多数需要盖温棚等设施，投资较大，加上石斛种植的技术要求高，目前市场尚未完全打开，发展速度还不是很快（张明等，2010）。
随着生物技术的发展，许多粮食作物如大麦（Rundle&Zielinski，1991）、水稻（Toetal，1999）、大豆（Yinetal，2014）等植物的RCA基因被克隆，但目前报道的RCA基因很少有涉及药用观赏植物，最近有朱明库等（2013）对羽衣甘蓝Rubisco活化酶基因BoRCA的克隆、生物信息学及表达分析的研究；袁秀云等（2016）对蝴蝶兰Rubisco活化酶基因PhRCAα的序列特征及在低温胁迫下的表达分析的研究；祝钦泷等（2011）对彩叶草Rubisco活化酶基因SsRCA进行了组织表达特异性和光诱导表达特性研究；曾淑华等（2012）已从铁皮石斛中克隆了光合碳途径关键酶磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因。因此，开展铁皮石斛RCA基因研究显得尤为必要。本研究为了提高石斛的质量，提高石斛光合效率，揭示铁皮石斛光合作用机理自然成了铁皮石斛研究领域的重要问题，该研究利用RACE技术克隆出铁皮石斛RCA2全长基因，并进行生物信息学分析，为进一步研究铁皮石斛光合作用调节机理奠定基础。
1材料与方法
1.1材料
铁皮石斛原产地为贵州，现在种植于河南省郑州市郑州师范学院兰花工程技术研究中心智能日光温室，植物材料为一年生铁皮石斛。
1.2方法
1.2.1RNA提取选取一年生铁皮石斛叶片，液氮速冻，保存于-80℃冰箱备用。叶片总RNA提取采用多糖多酚植物总RNA提取试剂盒（Tiangen公司）；采用1%琼脂糖凝胶电泳鉴定RNA的完整性；采用QuawellQ5000微量紫外可见分光光度计测定其A260/A280值及其浓度。
1.2.2RCA2基因全长的克隆以提取的叶片总RNA为模板，用反转录试剂盒合成单链cDNA。根据GENBANK上已知植物的RCA保守区，利用DNAMAN和Primer5.0生物軟件设计兼并引物（表1），扩增RCA保守片段。PCR反应体系为20.0μL：10×PCRbuffer2.0μL、dNTPMix2.0μL、上游引物RCAF1（10μmol·L1）1.0μL、下游引物RCAR1（10μmol·L1）1.0μL、模板cDNA1.0μL、rTaq酶（5U·μL1）0.2μL，加灭菌双蒸水至总体积20.0μL；反应程序为94℃预变性5min；94℃变性40s，56℃退火40s，72℃延伸40s，35个循环；最后72℃延伸10min。切胶回收目的片段，连接pGEMTEasy载体，转化大肠杆菌DH5α，挑选阳性克隆送至上海英潍捷基生物技术公司测序，获得RCA基因的保守区序列。再根据获得的保守区序列，分别设计5′端和3′端特异性巢式引物（表1），以叶cDNA为模板，用巢式PCR方式分别扩增RCA的5′端和3′端序列，按Clontech公司SMARTerTMRACE扩增试剂盒操作说明进行反应，回收扩增目的产物，克隆到pGEMTEasy载体上，转入大肠杆菌DH5α菌株，进行测序和拼接。
1.2.3ORF的扩增根据DNAMAN软件拼接得到RCA基因序列全长，利用Premier5.0设计1对特异引物RCAF2和RCAR2（表1），用于完整开放阅读框（ORF）的扩增。PCR扩增程序为94℃预变性5min，94℃变性45s，58℃退火45s，72℃延伸1min，进行35个循环，72℃延伸15min。ORF片段连接到pGEMTEasy载体上，转化大肠杆菌DH5α，测序进行ORF序列验证。
1.2.4生物信息学分析利用ORFfinder进行开放阅读框的预测；利用NCBI上的BLAST进行基因相似性的分析（http：//ncbi.nlm.nih.gov/blast/）；利用DNAMAN进行氨基酸序列比对分析；利用ProtScale程序（http：//expasy.org/tools/protscale.html）分析蛋白质亲疏水性；利用TargetP软件（UsingPLANTnetworks）和PSORTll（http：//psort.hgc.jp/form.html）进行亚细胞定位的分析；利用Protfun（http：//cbs.dtu.dk/services/ProtFun/）分析预测RCA2蛋白质结构功能和功能分类；利用ExPASy网站上的GOR进行蛋白质二级结构预测；利用ExPASy网站上的SWISSMODEL进行蛋白质三级结构的预测分析。
2结果与分析
2.1RCA2基因全长克隆
叶片总RNA提取后经1%琼脂糖凝胶电泳鉴定其完整性，检测结果显示，28S和18S条带清晰，A260/A280值1.96，浓度为210.56ng·μL1。
以铁皮石斛叶片总RNA反转录的cDNA为模板，以兼并引物RCAF1和RCAR2进行保守区片段PCR扩增，得到一个503bp保守片段（图1：B），根据设计的3′端和5′端特异引物，采用RACE技术，扩增获得3′端目的片段（图1：D）和5′端目的片段（图1：C）。利用生物软件DNAMAN进行序列拼接得到该基因的全长为1730bp，利用ORFfinder分析，共有9个ORF，该基因最长的ORF共计1323bp，包含81bp的5′UTR、326bp的3′UTR，编码440个氨基酸，将该基因命名为RCA2，GenBank登陆号为KT205842。利用引物RCAF2和RCAR2扩增获得1323bpORF片段（图1：A），连接到pGEMTEasy载体上测序验证，得到的阳性质粒命名为pGEMRCA2。
2.2RCA2基因全长的生物信息学分析
2.2.1RCA2核苷酸及编码蛋白序列的理化性质利用blastp和DNAMAN对RCA2氨基酸序列进行比对分析，发现该基因包含PloopNTPaseSuperfamily结构域，分别为“WGGKGQGKS”（A区）和“GKMCCLFINDLD”（B区），属于PloopNTPase超家族基因（图2）。理化性质分析该蛋白的分子质量为48.53kDa，等电点为6.19。将该基因全长核苷酸序列在NCBI上进行blastn相似性比较，结果表明基因均为RCA基因，且与蝴蝶兰（Phalaenopsis）的相似性高达87%。氨基酸序列比对分析，发现其氨基酸序列与蝴蝶兰、葡萄、荷花的相似性分别为89%、84%、85%（图3）。
2.2.2RCA2编码蛋白质的亲疏水性分析利用ProtScale分析蛋白的亲疏水性发现，RCA2蛋白质序列具有较高的亲水性，其中第69位的Thr亲水性最强（-3.078），第162位Leu的疏水性最强（2.122）（图4）。
2.2.3RCA2编码蛋白质的亚细胞定位蛋白的亚细胞定位与该蛋白所执行的功能是密切相关的，用TargetP和PSORTII软件进行亚细胞定位分析，TargetP预测结果显示RCA2蛋白定位于叶绿体基质，可信度为3（图5：A），用PSORTII预测蛋白显示，RCA2蛋白定位于叶绿体基质、线粒体基质间隙、叶绿体类囊体膜、叶绿体类囊体腔，RCA2蛋白主要存在于叶绿体基质（图5：B）。
2.2.4RCA2编码蛋白质的功能预测与分析利用ProtfunsoftwareofCBS分析预测RCA2蛋白质结构功能和功能分类，可能有意义的功能包括中间代谢、脂肪酸代谢、翻译、辅酶因子的生物合成和能量代谢等，他们的几率分别是5.484、4.387、4.048、3.639、3.098。这表明RCA2在中间代谢起到了一个非常重要的角色，在脂肪酸代谢、翻译中起到了重要作用，在辅酶因子的生物合成和能量代谢中也起到了关键作用。
2.2.5RCA2编码蛋白质的二级、三级结构预测采用ExPASy网站上的GOR进行蛋白质二级结构预测，结果表明，α螺旋占30.68%，延伸链占25.45%，不规则折叠占43.86%（图6）。用ExPASy网站上的SWISSMODELWorkspace预测蛋白质的三维结构以4w5w.1.A（SMTLid）为模板进行建模，该模板以XRAY2.90方法产生，与RCA2蛋白一致性为86.02%（图7）。
3讨论与结论
该研究通过RTPCR和RACE技术方法，成功克隆了铁皮石斛RCA2基因（GenBank登录号KT205842）全长1730bp，开放阅读框1323bp，编码440个氨基酸；核苷酸序列分析结果表明，RCA2核苷酸序列与蝴蝶兰（Phalaenopsis）的相似性高达87%，其编码蛋白属于PloopNTPaseSuperfamily家族基因。蛋白理化性质分析该蛋白的分子质量为48.53kDa，等电点为6.19，为亲水性蛋白，RCA2编码蛋白质的亚细胞定位于叶绿体基质；编码蛋白质的功能包括中间代谢、脂肪酸代谢、翻译、辅酶因子的生物合成和能量代谢等，蛋白质三级结构预测模型与RCA2蛋白一致性为86.02%，这些生物学参数为进一步研究RCA2蛋白的酶学性质及其在铁皮石斛中的光合作用机理奠定了理论基础。
关键词：蓖麻（Riciuns communis L.）；油体固醇蛋白质；生物信息学
中图分类号：S565.6 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2016）11-2930-04
DOI：10.14088/ki.issn0439-8114.2016.11.056
蓖麻（Riciuns communis L.）是大戟科（Euphorbiaceae）蓖麻属（Ricicuns）一年或多年生双子叶植物，广泛生长在热带、亚热带和温带地区，是世界十大重要油料作物之一[1]。植物种子中有一种储存营养物质的细胞器――油体[2-4]，其内部主要成分为三酰甘油，外部则为磷脂单分子层及嵌入其内的油体结合蛋白质组成的半单位膜[5]。油体结合蛋白质主要有三种――油脂蛋白质、油体钙蛋白质和油体固醇蛋白质。油脂蛋白质由N-和C-末端两个亲水区域及中间疏水锚定区域组成。N-和C-末端暴露在油体表面，能够提供空间位阻和负电斥力来维持油体的稳定[5]。Chen等[6]在油体中发现了3种微量蛋白质分别称为Sop1、Sop2、Sop3。Sop1称为油体钙蛋白质。油体钙蛋白质由N-端亲水钙结合区域、C-端亲水性磷酸化区域和中间疏水锚定区域组成，可能在油体成熟、脂肪动员和提高油体稳定性方面发挥作用[5]。Sop2、Sop3被称为油体固醇蛋白质-A和油体固醇蛋白质-B[7]。油体固醇蛋白质是一种羟基固醇脱氢酶，属于SDR家族[8，9]。N-端的疏水区域由两个亲性α螺旋夹着一个疏水锚定结构组成，在此疏水区域中部有Pro knob结构[10]，其余部位分为NADPH、固醇结合区域和两者之间的活性位点S-（12X）-Y-（3X）-K[10]。Sop3和Sop2蛋白质的固醇结合区域不同[7]。近来发现油体蛋白质也存在于根尖和芽等胚后组织中，推测在植物体内还存在未被发现的信号转导通路[8]。本试验以拟南芥蛋白质作“种子”在蓖麻的蛋白质数据库中搜索，结合关键字搜索方法对蓖麻油体固醇蛋白质进行生物信息学分析，以期为该蛋白质的鉴定提供参考。
1 材料与方法
1.1 蓖麻基因组数据库搜索
以“Steroid dehydrogenase”为关键字在蓖麻基因组数据库（http：///search.php）中搜索，下载基因、cDNA和蛋白质序列；以6条拟南芥油体固醇蛋白质[11]作为“种子”，分别在蓖麻数据库（http：///search.php）中进行Blastp搜索，E设为1×10-30，获得同源的油体固醇蛋白质的基因、cDNA和蛋白质序列，去除重复后，再利用NCBI保守结构域分析工具（http：//ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi？）对所获得的蛋白质家族进行鉴定，检测是否有SDR（短链脱氢/还原酶超家族）的保守结构域。
1.2 蓖麻油体固醇蛋白质生物信息学分析
蓖麻油体固醇蛋白质的理化性质采用Protparam软件进行预测；内含子、外显子组成采用Spidey软件进行分析；疏水性/亲水性采用ProtScal软件进行分析；蛋白质二级结构分析采用GOR4软件进行分析；蛋白跨膜结构域采用TMHMM 2.0 Server软件；信号肽结构采用SignalP4.1 Server软件进行预测；蛋白质三维结构分析与同源建模采用CPHmodels软件和RasMol-Raindy软件；进化树的构建采用软件ClustalW2软件和MEGA 4.1软件，所有软件使用的都是其默认值，部分分析软件的网址见表1。
2 结果与分析
2.1 蛋白质的一级结构分析
2.1.1 氨基酸序列的理化性质分析 通过综合分析，最终获得11条完整的蓖麻油体固醇蛋白质基因，见表2。利用在线分析软件Protparam对10种油体固醇蛋白质进行分析，得到其对应的氨基酸序列的理化性质，结果见表2。大部分蛋白质成员外显子数为3或6，氨基酸残基数为317～352，分子量为35.286 0～39.918 9 kDa，等电点PI为5.35～9.57。不稳定系数表明，有8种成员在植物内可能阶段性出现。亲水性大部分都为正值，大部分成员都为亲水蛋白质。信号肽预测表明，这11个蛋白质不存在信号肽。由于Slo11蛋白质基因不完整，所以后续分析中只选择其他10个蓖麻油体固醇蛋白质。
2.1.2 疏水性/亲水性的预测和分析 采用ProtScale软件对10个蓖麻油体固醇蛋白质进行分析，结果（图1）表明，以Slo1、Slo9为例，1～40区域有强烈的疏水性，可能为跨膜区域与油体内部疏水的三酰甘油相接合处，其他区域无明显规律。
2.1.3 跨膜结构的预测和分析 利用在线软件TMHMM 2.0 Server对10个蓖麻油体固醇蛋白质进行跨膜结构预测，图2结果表明，除了Slo5蛋白质在氨基酸25、200位点各有一个跨膜区，其他9个蛋白质（如Slo9）均只在25位点处有一个跨膜结构。
关键词：弓形虫；SAC1基因；体外扩增；生物信息学分析
中图分类号：R382.5 文献标识码：A 文章编号：1007-7847(2007)04-0348-04
弓形虫(Toxop1asma gondii)是一种专性细胞内寄生原虫，可感染包括人类在内的所有哺乳动物的有核细胞，正常人感染弓形虫后，多呈无症状带虫免疫状态，但孕妇感染后，则可致流产、死胎以及胎儿先天畸形，弓形虫作为一种重要的机会性致病原虫，已成为导致免疫缺陷患者死亡的主要原因之一，sAC1是刚地弓形虫速殖子主要表面抗原之一，其分子质量约为30kD，研究表明3AC1在弓形虫入侵宿主的过程中发挥了双重作用，它不仅在介导弓形虫速殖子入侵宿主细胞的过程中发挥了重要作用，而且还可引发宿主体内强烈的抗原抗体反应，此种免疫原性特质，使其成为诊断性抗原与免疫性抗原的重要候选基因，本文根据RH株54C1基因序列参考相关文献设计并合成了一对寡核苷酸引物，采用PCR技术从弓形虫RH株基因组DNA中扩增编码SAC1基因片段，并对其进行序列测定及生物信息学分析，为进一步通过基因工程进行表达做准备，同时也为体外研究弓形虫SAC1基因的结构与功能及其在免疫诊断学中的应用打下了基础。
1 材料和方法
1．1 材料
1．1．1 主要试剂及工具酶
TaqDNA聚合酶(Takara公司)；dNTPs、蛋白酶K(上海生物工程公司)；Tris碱、SDS、EDTA、酚、氯仿均为国产分析纯。
1．1．2 虫株
弓形虫RH株由中山大学医学院陈观今教授惠赠。
1．1．3 实验动物
SPF级昆明小鼠，6～8周龄，18～20g，购于广东医学实验动物中心。
1．2 方法
1．2．1 引物的设计与合成
根据GenBank中弓形虫54C1基因序列(序列号：S76248)311～1321位，设计一对引物P1和P2，P1：5'-ATGTCGGTTTCGCTGCACCACTT-3，，P2:5-TACGCGACACAAGCTGCGATAGAGCC-3'，引物由上海生工合成，并经PAGE纯化。
1．2．2 弓形虫基因组DNA提取
弓形虫RH株速殖子复苏后，每只0.3m1腹腔接种感染昆明小鼠，3～5d后，脱颈处死小鼠，腹腔注入2m1 PBS，收集腹水，PBS洗涤两次，离心收集虫体，加100mmo1/1Tris-C1，5 mmo1/1EDTA，200 mmo1/1 NaC1，1％SDS，100mg/1蛋白酶K，55℃震荡过夜，然后分别用饱和酚、氯仿／异戊醇各抽提一次，等体积异丙醇沉淀，沉淀溶于100μ1三蒸水中，-20℃保存备用。
1．2．3 目的基因片段的PCR扩增
在0.2m1 Eppendoff管中依次加入下列成份：ddH2O 36.75μ1 10x缓冲液5μ1、dNTP(10mmo1/1)1μ1、正反向引物(20μmo1/1)各1μ1、模版DNA 5μ1，Taq酶0.25μ1，总反应体积为50μ1.95℃预热10min后，94℃60s，50℃60s，72℃ 120s，行30个循环，将PCR产物5tx1在含溴化乙锭的1％琼脂糖凝胶中电泳，UVP观察结果并拍照。
1．2．4 DNA序列测定
PCR产物由上海英骏生物技术公司进行序列测定。并与GenBank中的基因序列(S76248)进行同源性比对。
1．2．5 克隆序列的生物信息学分析方法
利用ExPASy中的Trans1ate程序将jAC1基因的核苷酸序列翻译成蛋白质氨基酸序列，通过protparam(us.省略/egi-bin/protparam)分析SAG1蛋白的物化参数，采用NCBI服务器中的CDD程序对氨基酸序列进行保守功能域分析，判断该基因是否具有完整的保守结构域，进一步推断对应的核苷酸序列是否具有完整的开放读码框，采用InterPro程序(ebi.ac.uk/InterProSean)对SWISS-PROT数据库进行检索，寻找氨基酸序列的功能结构域，了解目的序列可能的功能性质，利用NPS及Singa1 IP3.0及PSORT服务器，对蛋白质的二级结构及折叠类型、信号肽位置、亚细胞定位及跨膜螺旋域进行预测，进一步了解目的序列的基本特征。
2 结果
2．1 目的基因扩增
从弓形虫RH株基因组DNA异扩增出编码SAG1表面抗原基因片段，PCR产物行1％琼脂糖凝胶电泳鉴定，
2．2 SAG1基因序列测定
以PCR扩增的特异引物，从正反两个方向进行测序，双向测序的结果相吻合，与GenBank中所给的基因序列(S76248)相比对，所扩增序列位于sAC1基因组DNA序列的311～1321处，共1006个碱基，包含了SAC1基因开放读码框内的所有碱基，扩增序列的第519位发生了G-A突 变，但并不影响其编码的氨基酸序列，ACG及ACA编码的均为苏氨酸。
2．3 克隆序列的生物信息学分析结果
2．3．1 54C1基因的氨基酸序列
利用ExPASy中的Trans1ate程序将SAG1基因的核苷酸序列翻译成蛋白质氨基酸序列，可知其编码336个氨基酸，结果如下：
2．3．2 物理化学特性分析
通过protparam(us.省略/cgi-bin/protparam)分析SAG1蛋白的物化参数，分析结果表明，34C1分子质量为83495.2，理论等电点为5.04，在哺乳动物、大肠杆菌、酵母中的半衰期分别为4.4h(体外)、＞20h(体内)、＞10h(体内)，不稳定指数为46.93，脂溶性指数为24.73，两亲性指数为0.82。
2．3．3 保守结构域搜索
利用NCBI的CDD程序对SAG1的保守结构域进行搜索，结果显示SAG1有两个保守结构域，分别位于其氨基酸序列的54～176位及184～300位，这两个保守结构域在介导弓形虫对宿主细胞的粘附以及引发宿主免疫反应的过程中起到了重要作用。
2．3．4 氨基酸功能域搜索
采用InterPro程序对SWISS-PR07蛋白质数
据库进行检索，对SAG3的氨基酸功能域进行预测，对搜索结果进行分析总结，推测SAG3的氨基酸功能域可能位于54～176位与184～301位之间。
2．3．5 二级结构和折叠类型预测结果
NPS同源比对发现SAG1二级结构主要由α-螺旋，β-折叠和不规则卷曲组成，其中α-螺旋占18.75％，β-折叠占27.71％，无规则卷曲占59.71％。
2．3．6 信号肽预测
利用Singa1 IP3.0及PSOR了psort.nibb.ac.jp/form.htm1服务器对SAG1进行信号肽预测，结果显示其编码的氨基酸序列的前47个氨基酸为信号肽序列。
2．3．7 蛋白跨膜螺旋及亚细胞定位预测
应用PSORT Prediction对SAG1进行跨膜螺旋及亚细胞定位预测，发现其跨膜域位于第320～336位，为典型的Ia型跨膜蛋白，为GPI锚定蛋白，存在于细胞膜上的可能性为91％，在溶酶体膜上存在的可能性为20％，在内质网膜和腔内存在的可能性各为10％。
3 讨论
自Burg JL对弓形虫sA C1的全部基因序列发表后，国内外一些学者对弓形虫几个分离株进行PCR克隆、测序、表达，国内的陈晓光等曾试过在不同的表达系统中表达SAG1，包括在大肠杆菌中的非融合的pBV220系统和融合的pRSE了系统以及杆状病毒系统，龚娅等以及陈晓光等分别构建了弓形虫重组质粒pET-SAC1，使SAC1在PET系统中表达，朱翔等构建了PGEX-SAC1重组质粒，使其在PGEX系统中表达，我们从弓形虫RH株的基因组中成功的克隆扩增出了SAC1基因序列，经测序证明，仅第519位发生了G-A突变，且为无意突变，并利用ExPASy中的Trans1ate程序将SAC1基因的核苷酸序列翻译成蛋白质氨基酸序列后，利用生物信息学软件分析得出其具有一定的疏水性，具有信号肽序列，信号肽剪切位点约位于第47位，为GPI锚定蛋白，跨膜域位于320～336位，为典型的Ia型跨膜蛋白，与国外学者实验鉴定结果相符合。
关键词：玉米（Zea mays L.）；淹水胁迫；诱导表达；启动子
中图分类号：S512.1；Q789 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2013）23-5880-04
洪涝灾害给农作物造成了很大的损失，仅南亚地区每年有超过15%的玉米（Zea mays L.）种植面积遭受不同程度的危害[1]。玉米是我国种植面积最大的农作物之一[2]，但由于南方地区季节性降雨，玉米苗期经常遭受绵绵春雨，花期和灌浆期则往往遭遇梅雨，排灌系统不良、低洼地区的春玉米经常遭受洪涝灾害。我国受洪涝灾害的农田面积平均每年达956万hm2，其中严重的年份，受灾面积达1 500万hm2以上[3]。
乙烯反应因子（Ethylene response factors，ERF）是乙烯信号途径调控的重要因子，参与植物生物和非生物胁迫的表达调控[4-6]。研究发现ERF基因参与了水稻（Oryza sative L.）和深水稻的淹水胁迫响应。在淹水条件下Sub1A基因可以抑制乙烯的产生，限制叶片和节间的伸长，降低叶绿素的降解和碳水化合物的消耗，而使水稻生长处于“静止”状态，并在退水后能迅速恢复生长[7]。Xu等[8]克隆了Sub1A基因，并通过转基因技术将Sub1A基因导入到不耐淹水的粳稻材料中，提高了耐淹水性。Hattori等[9]从深水稻中克隆了2个ERF基因，分别是SNORKEL1和SNORKEL2。淹水条件下，深水稻体内乙烯的积累，诱导了SNORKEL1和SNORKEL2基因的表达，促进了节间的显著伸长，从而使深水稻的茎秆伸出水面，避免遭受溺亡。拟南芥（Arabidopsis thaliana）RAP2.2也是一个ERF基因，在根部表达量较高。转基因结果证实上调RAP2.2基因的表达，提高了拟南芥耐淹水性，相反敲除RAP2.2基因，拟南芥对淹水非常敏感；同时，RAP2.2基因上调表达的转基因株系，其ADH1和PDC酶的活性较高[10]。
以上研究表明，ERF基因参与了水稻、深水稻和拟南芥的淹水胁迫响应，是耐淹涝的关键基因。课题组使用生物信息学方法，从玉米基因组中获得了107个ERF基因，并使用RNA-seq技术，分析了这些基因在玉米自交系Hz32（耐渍系）根系不同淹水条件下的表达情况，发现ZmERF2基因受淹水胁迫诱导表达（待发表）。本研究分别从玉米自交系Hz32和Mo17（敏感系）中克隆出了ZmERF2基因的启动子，并对该启动子进行了生物信息学分析，将有助于进一步揭示玉米耐渍性形成的分子机制。
1 材料与方法
1.1 材料
耐渍性较强的玉米自交系Hz32和耐渍性较弱的玉米自交系Mo17，均由华中农业大学张祖新教授惠赠。
1.2 方法
1.2.1 玉米基因组DNA的提取 利用改进的CTAB法[11]分别提取玉米自交系Hz32和Mo17的基因组DNA。
1.2.2 玉米根系总RNA的提取与cDNA第一链的合成 玉米自交系Mo17、Hz32于三叶一心期，分别进行0、4 h的淹水处理。使用植物总RNA提取试剂盒（北京百泰克生物技术有限公司），分别提取各处理根系的总RNA。将各处理的总RNA作为模板，使用cDNA第一链合成试剂盒（北京全式金生物技术有限公司），分别合成cDNA第一链。
1.2.3 PCR引物的设计 根据玉米自交系B73 ZmERF5基因序列，分别设计用于RT-PCR和PCR扩增的引物，引物序列见表1。引物GSP1-F、GSP1-R用于RT-PCR，分析不同淹水处理ZmERF5基因在Mo17、Hz32根系的表达情况。引物GSP2-F、GSP2-R用于PCR扩增ZmERF5基因启动子。
1.2.4 ZmERF5基因表达的RT-PCR分析 分别提取淹水0、4 h处理的Mo17、Hz32根系总RNA，并分别合成cDNA第一链。将合成的cDNA第一链作为模板，进行RT-PCR分析。RT-PCR扩增体系为：10×Taq Buffer 2.5 μL，2 mmol/L dNTPs 2.0 μL，上、下游引物各1.0 μL，Taq DNA 聚合酶（5 U/μL）0.2 μL，cDNA 1.0 μL，ddH2O 17.3 μL。RT-PCR扩增程序为：94 ℃预变性3 min；94 ℃变性60 s，60 ℃退火60 s，72 ℃延伸90 s，35个循环；72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。取8.0 μL RT-PCR产物以1%琼脂糖凝胶电泳分析，并于凝胶成像系统拍照、保存。
1.2.5 ZmERF5基因启动子的克隆 分别以Mo17、Hz32的基因组DNA为模板，进行PCR扩增，扩增体系为：10×Taq Buffer 2.5 μL，2 mmol/L dNTPs 2.0 μL，上、下游引物各1.0 μL，Taq DNA 聚合酶 （5 U/μL）0.2 μL，50 ng/μL DNA 1.0 μL，ddH2O 17.3 μL。PCR扩增程序为：94 ℃预变性3 min；94 ℃变性60 s，63 ℃退火60 s，72 ℃延伸90 s，35个循环；72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。PCR产物以1%琼脂糖凝胶电泳分析。
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【摘要】 目的 在大肠杆菌中表达人神经肽Y Y2受体，并对之进行纯化、鉴定及生物信息学分析。方法 取已构建好且经测序确认无误的重组质粒pET28aY2转化大肠杆菌BL21(DE3)，IPTG诱导表达融合蛋白，并经SDSPAGE检测和Western 印迹鉴定，表达产物包涵体经Ni2+NTA亲和层析纯化。然后利用相关在线软件进行生物信息学分析Y2受体蛋白。结果 经IPTG诱导含有pET28aY2重组质粒的DE3菌，表达出重组人Y2融合蛋白。重组蛋白经Ni2+NTA亲和层析进行纯化后，得到了较高纯度的融合蛋白。经相关在线软件分析后获得了Y2受体的相关生物学特性。结论 重组质粒pET28aY2在大肠杆菌DE3中成功表达，亲和层析纯化后获得较高纯度融合蛋白，并对Y2受体蛋白的生物学特征进行了预测，为进一步研究其生物学功能及其抗体的研制奠定了基础。
【关键词】 人神经肽Y Y2受体;融合蛋白;包涵体;纯化;生物信息学
【Abstract】 Objective To express human Y2 receptor protein in E. coli，purify and identify it，and conduct bioinformatic analysis of Y2 receptor protein. Methods The recombinant plasmid pET28aY2 which had been well constructed and sequentially confirmed was transplanted into E.coli BL21(DE3) and induced by IPTG to express fusion proteins. SDSPAGE and Western blot were used to test and identify the expressed fusion proteins. The inclusion body of the expressed product was purified by Ni2+NTA affinity chromatography. Then bioinformatic analysis of the Y2 receptor was conducted with the help of related online software. Results After being induced by IPTG，the DE3 with recombinant plasmid pET28aY2 expressed recombinant human Y2 receptor protein. Highly purified fusion protein was obtained by Ni2+NTA affinity chromatography. Related biological characteristics of Y2 receptor were obtained after the online software analysis. Conclusions The recombinant plasmid pET28aY2 can be successfully expressed in DE3. Highly purified proteins can be obtained by Ni2+NTA affinity chromatography. Y2 receptor′s biological characteristics are predicted， which lays foundation for further studies of Y2 receptor protein′s biological function and antibody development.
【Key words】 NeuropeptideY Y2 receptor; Fusion protein; Inclusion body; Purification; Bioinformatics
神经肽Y(NPY)是由36个氨基酸组成的多肽，属于胰多肽家族，作为一个信号分子在不同物种间有高度的保守性。人体内NPY相关的受体主要存在于中枢神经组织中，此外在外周组织也有分布。其中与脂肪组织相关的受体主要有Y1、Y2和Y5〔1，2〕。NPY通过与其受体Y2(NPY2R)的作用刺激内皮细胞增殖分化，在血管生成过程中重要的作用〔3，4〕，Kuo等〔1〕的研究表明NPY在脂肪重塑、饮食诱导的肥胖加剧及伴随的代谢综合征形成中有重要的作用。他们认为，NPY与NPY2R相互作用，通过血管生成引起内皮细胞及脂肪细胞的增殖、分化，表明NPY及NPY2R可作为媒介用以增加移植脂肪组织的体积和存活。
1 材料与方法
1.1 材料 E.coli BL21(DE3)、含有测序正确的重组质粒pET28aY2的保存菌均由本室保存;蛋白Marker购自TaKaRa公司;鼠抗人Anti6×His抗体、辣根过氧化物酶(HRP)标记的山羊抗小鼠IgG 均购于天根生化科技有限公司;镍离子亲和层析预装柱及化学发光显色试剂购于QIAGEN公司;蛋白电泳仪、电转移仪(BioRad公司);cientzIID超声细胞粉碎机为宁波新芝科器研究所产品;其他所用试剂均为国产分析纯。
1.2 方法
1.2.1 重组人NPY2R融合蛋白的诱导表达 用接种环沾取少量含有重组质粒pET28aY2的保存菌，于LB(Kan+)平板上划线，37℃倒置培养过夜。次日挑取单菌落，接种于5 ml LB (Kan+ )液体培养基，37℃振摇培养过夜。次日取培养过夜菌液500 μl 再接种于50 ml选择性LB 液体培养基中，振荡培养至OD600值达0.6。吸取1 ml后加入IPTG，终浓度为1 mmol/L，37℃继续诱导培养4 h。取加IPTG前和后的菌液各1 ml，12 000 r/min离心5 min，收集菌体沉淀，并于沉淀中加50 μl蒸馏水，混匀后再加2×SDSPAGE上样缓冲液50 μl，混匀，沸水浴5 min，12 000 r/min离心10 min，每个样品取20 μl上样于10%的SDSPAGE凝胶电泳，电泳结束后取考马斯亮兰R250染色2 h，然后脱色，拍照记录结果。
1.2.2 包涵体的释放 据上所述，在2 000 ml的摇瓶中装500 ml的LB液体培养基扩大诱导规模。将诱导表达菌液，4℃，5 000 r/min，离心15 min，收集菌体沉淀;加入25 mlPBS，吹打充分悬浮菌体沉淀，4℃，12 000 r/min，离心30 min，弃去上清，依此反复冲洗菌体沉淀3次;加入细胞裂解液25 ml，吹打使菌体沉淀均匀悬浮;将菌体沉淀悬浮液置-20℃冷冻，再于室温融化，如此反复冻融3次;4℃，12 000 r/min，离心细菌冻融液30 min，弃去上清，在沉淀中加入超声裂解液25 ml，吹打混匀;置冰上对细菌冻融液进行超声处理，10 min/次，处理时间30 min;超声处理后，于4℃，12 000 r/min，离心30 min，弃去上清，沉淀为菌细胞裂解沉淀物。
1.2.3 包涵体的提纯 于菌细胞裂解沉淀物中加入含4 mol/L尿素的包涵体提纯液25 ml，吹打混匀，室温静置30 min，12 000 r/min离心30 min，反复3次，即得到包涵体沉淀物。
1.2.4 包涵体的裂解 于包涵体沉淀物中加入包涵体裂解液25 ml，吹打混匀，室温静置6 h，使包涵体充分裂解，2 000 r/min离心30 min，收集上清液，即为包涵体裂解物。
1.2.5 变性蛋白的复性 将收集的包涵体裂解物上清液加入到处理过的透析袋中，扎紧透析袋两端;将透析袋整体浸没于蛋白复性液，在4℃条件下透析;复性液中的尿素浓度从7～1 mol/L依次递减，在每个尿素浓度梯度复性液中透析3～4 h。每次更换不同尿素浓度复性液之前，需要将透析袋内的样品吸出，4℃，12 000 r/min，离心30 min，再把上清液加入透析袋内，重新扎紧进行透析;透析完毕后，将样品取出，4℃，12 000 r/min，离心30 min，再将上清液加入透析袋，在4℃预冷的PBS中透析20 h;取出透析好的样品，4℃，12 000 r/min，离心30 min，收集上清液即为复性产物。-70℃保存。
1.2.6 复性产物的纯化 ①上样：将复性产物缓慢加于已用PBS缓冲液平衡的镍离子亲和层析预装柱中，加样所用的流速要控制在1 ml/min以内;②冲洗：PBS洗涤除去未结合蛋白，冲洗流速应控制在5 ml/min以内;③洗脱：分别用含50、100、150 mmol/L咪唑PBS缓冲液洗脱融合蛋白，流速5 ml/min。
1.2.7 纯化产物Western印迹检测 取纯化后产物20 μl上样于10%的分离胶SDSPAGE电泳后，电转移至硝酸纤维素膜上，进行Western印迹分析。一抗为鼠抗人Anti6×His(1∶1 000稀释)，二抗为辣根过氧化物酶偶联的羊抗鼠IgG抗体(1∶5 000稀释)，采用化学发光法显影，于X光片上曝光。
1.2.8 生物信息学 对所表达的NPY2R融合蛋白分别利用在线软件(expasy.org/tools/protparam.html)进行氨基酸组成及理化性质分析;利用在线软件(ca.expasy.org/tools/protscale.html)进行疏水性分析;利用在线软件(ch.embnet.org/software/TMPRED_form.html)进行跨膜分析;利用在线软件(cbs.dtu.dk/services/SignalP/)进行信号肽分析;利用在线软件(npsapbil.ibcp.fr/cgibin/npsa_automat.pl?page=npsa_nn.html)进行二级结构预测;利用在线软件(swissmodel.expasy.org/workspace/index.php?func=modelling_simple1)对三级结构进行预测;最后利用Harvard大学的在线生物信息学软件(bio.dfci.harvard.edu/Tools /antigenic.html) 进行抗原表位预测。
2 结 果
2.1 诱导pET28aY2表达NPY2R结果 pET28aY2表达的NPY2R在N端有非NPY2R的36个氨基酸的融合蛋白，其中有6个组氨酸的tag(Histag)，目的蛋白NPY2R由381个氨基酸组成，即pET28a2Y表达的完整融合蛋白由417个氨基酸组成，分子量约47 kD。见图1。
2.2 融合蛋白纯化后的鉴定 NPY2R蛋白在含150 mmol/L咪唑PBS缓冲液可以完全被洗脱，分别进行10%的SDSPAGE电泳鉴定，见图2。
2.3 纯化蛋白的Western印迹结果 用化学发光法显影，X光片曝光后可见一清晰条带，表明目的蛋白得到有效表达和纯化，见图3。
2.4 NPY2R的生物信息学分析
2.4.1 氨基酸组成及理化性质分析 利用expasy.ch中的Expasy protparam tool对NPY2R的理化参数进行预测。预测编码区编码的氨基酸数目为417个。碱性氨基酸总数(Arg+Lys=35)等于酸性氨基酸总数(Asp+Glu=35) 。预测相对分子量为46.55 kD，等电点pI为7.27。其半衰期在体外哺乳动物网织红细胞为30 h，在酵母体内大于20 h，在大肠杆菌体内大于10 h。不稳定系数为31.63，归类为稳定蛋白(当一个蛋白质的不稳定系数>40时，则该蛋白质不稳定)。
2.4.2 疏水性分析 蛋白质分子的基本特性之一是亲水的极性部分在分子的表面，疏水的非极性部分在分子内部。因此，根据每种残基的极性和氨基酸序列就能较容易地了解到一级结构中不同肽段的极性，从而估测出不同肽段在分子内外的定位。用Expasy软件估测了NPY2R极性，结果见图4。横坐标为蛋白质氨基酸残基的序号，纵坐标表示残基的疏水亲水的特性;正值为疏水，负值为亲水。从图中可以看出，NPY2R具有较强的疏水性，位于分子的内部。
图4 NPY2R的疏水性分析
2.4.3 跨膜性分析 膜蛋白主要有两大类:内膜蛋白和外膜蛋白，内膜蛋白与细胞膜结合的主要方式是肽段直接跨过细胞膜，即跨膜蛋白，另外还可以通过脂肪基与细胞膜发生共价结合，蛋白可在胞内，也可在胞外。跨膜蛋白在细胞中常以离子通道形式存在，执行信号传导或物质转运功能。利用在线软预测，发现有7个跨膜结构区(如图5示，X轴为氨基酸系列位置，Y轴为氨基酸平均疏水指标)。
图5 NPY2R的跨膜性分析
2.4.4 信号肽分析 将NPY2R蛋白序列提交到在线软件分析NPY2R是否有信号肽存在，输出结果见图6，NPY2R蛋白N端1～70位氨基酸序列中没有发现明显的信号肽酶切位点，Y平均值较低，未发现信号肽序列存在。因此，推测NPY2R不存在信号肽，该蛋白不是分泌蛋白。
图6 NPY2R的信号肽分析
2.4.5 二级结构分析 预测结果见图7，表明NPY2R蛋白的二级结构由49.40%的α螺旋、13.43%的延伸链、37.17%的无规卷曲组成。
图7 NPY2R的二级结构分析
2.4.6 三级结构分析 蛋白质高级结构的预测和分析，对理解蛋白质结构与功能之间的相关性有着极其重要的意义。将NPY2R的氨基酸序列提交给SWISSMODEL三级结构预测服务器，未能生成预测的结果。
2.4.7 抗原性分析 利用在线软件对NPY2R的抗原性进行分析，结果见图8，有10个抗原决定簇可供选择，以便进行相关实验。
图8 NPY2R的抗原性分析
3 讨 论
NPY2R缺失小鼠能够明显减少摄食、降低脂肪沉积和减轻体重〔5〕，在大鼠和小鼠外周注射NPY2R 抑制剂PYY3236 均可抑制摄食，降低体重，而在NPY2R 缺失模型鼠中却无此作用〔6〕。这表明NPY2R与摄食和肥胖密切相关。为了探明是否NPYNPY2R信号系统能剌激体内脂肪量的增加，研究者使用遗传性的肥胖鼠B6.VLepob/J，这种鼠具有能进行中枢性的调节摄食过量、削弱新陈代谢及减少交感性嗜铬细胞活性的特点。与对照组鼠相比，这些鼠血清NPY水平高出正常值的200%，并且明显地上调腹部皮下脂肪的NPY及其受体Y2的表达。这也支持了一种观点，即循环的NPY来源于脂肪组织。利用腹部皮下脂肪源性的NPY进行处理后，可观察到在肥胖及消瘦鼠体内脂肪组织的质量及体积增加了50%。而相反的是，注射NPY Y2受体拮抗剂可降低肥胖及消瘦鼠体内脂肪量及体积的50%。
Baker 等〔7〕研究表明NPY与Y2受体作用可引起机体内新的脂肪生成，并可减少机体对移植脂肪的吸收。他们以鼠及猴为对象进行的研究表明将包有NPY并能稳定释放14 d的缓释药片植入到鼠的皮下组织中，在药片植入的周围会有新的脂肪生成，而且这种脂肪能够至少维持3个月。同时将含有NPY的药片植入到两只猴子腹部的皮下组织中，NPY的用量与给鼠的用量一样，但1个月后通过MRI检测，同样可以观察到脂肪细胞的生成。
本课题组在完成重组人源化NPY2R基因克隆及序列分析〔8〕的基础上，将NPY2R基因与pET28α载体连接后表达于DE3中。pET28α表达载体在N端含有HisTag寡聚组氨酸链，因此，表达出的融合蛋白在多种情况下都可以便利地和经济地进行纯化。本课题组设计的NPY2R融合蛋白N端为36个氨基酸组成的非目的蛋白，其中包含一个Histag，其后的目的NPY2R蛋白有381个氨基酸。即pET28aNPY2R表达的融合蛋白共由417个氨基酸组成，分子量约50 kD左右。用6×histag抗体进行western 印迹鉴定，表明有大量融合蛋白产生。其分子量与NPY2R融合蛋白相符。目前已完成包涵体的裂解、复性及纯化，其生物学活性还有待测定。此外，本课题组利用生物信息学软件对天然NPY2R在一级结构、二级结构、三级结构等多方面进行了分析和预测，并对其生物学性状有了进一步的了解，为今后以NPY2R为对象进行的研究准备了物质及理论基础。但是，对于NPY2R融合蛋白的生物信息学分析尚待进一步研究。
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[关键词] 同位单核苷酸多态；人表皮生长因子前体蛋白；非同位单核苷酸多态；生物信息学
[中图分类号] R786 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2014）01（a）-0014-05
人表皮生长因子前体蛋白（prepro-epidermal growth factor，preproEGF）mRNA/cDNA序列由24个外显子组成，长约5 kb，编码一条1207个氨基酸的蛋白多肽链，该肽链在翻译生成后经蛋白酶剪切加工形成的成熟表皮生长因子（一段53个氨基酸多肽）对人体表皮细胞的生长、分化和代谢起着十分重要的作用[1]。也许由于mRNA序列转录的选择性剪接加工等生物学机制的缘故，基因在表达时常常会出现蛋白多肽变体，目前已知的preproEGF变体有肾源和其他组织源两类。另一方面，preproEGF基因序列的遗传多态，特别是单核苷酸多态（single nucleotide polymorphysims，SNPs）也可致其出现变体或功能改变，还可引起疾病的发生[2-3]，例如，迄今的研究已表明，分布在preproEGF基因第61 bp位点的SNP（A/G）与欧美人某些肿瘤例如黑色素瘤等发生具有相关性[4]。可见深入探明SNPs及其在preproEGF基因或mRNA/cDNA中的分布情况对于探索疾病相关性的研究颇具指导价值和医学意义。至目前为止，SNPs在preproEGF基因组DNA序列内之生物信息学分布及其在第20、21外显子和其间内含子区段中呈现稀疏分布的特点于近期已见报道[5-6]，但其在mRNA/cDNA序列中的情况如何则尚待探明。本研究拟借助NCBI的生物信息学平台对SNPs及其在preproEGF核酸或mRNA/cDNA序列中的分布进行分析定位和标注图解，为进一步的疾病相关性研究和医学应用提供基础。
1 对象与方法
1.1 研究对象
人preproEGF基因和蛋白多肽及其变体的mRNA/cDNA序列。
1.2 仪器和信息资源
计算机（联想公司）、电讯宽带网路（中国电讯）、NCBI的生物信息程序和dbSNP。
1.3 方法
从电讯宽带登录网址nlm.nih.gov，参照研究介绍的方法检索分析和定位注释存在于preproEGF多肽及其变体mRNA/cDNA序列中的SNPs[7-9]。
2 结果
经Blast和Entrez SNP检索到在人4号染色体上分两类preproEGF多肽的mRNA/cDNA序列中存在有不同数目和种类的SNPs，可依其rs#从5'端到3'端行顺序编号并归位其在核酸序列中的位点，同时计算各相邻SNP位点之间的距离。见表1、2。
由表1、2可见，编号于人两类preproEGF多肽mRNA/cDNA序列中的SNPs在种类数目上有所不同，即肾源类SNPs为51个，而其他组织源类却为55个，总计106个SNPs。进一步观察对比这两类SNPs可见，其大多数（84个或42对）是位点及种类皆同一或同位的，主要分布在外显子序列中；而少数（肾源类9个，其他组织源类13个）却表现出非同位或各自不相同的，主要分布在3'端非编码序列中。合并表1和表2的资料信息，可绘制成SNPs及其在两类preproEGF多肽mRNA/cDNA序列中的分布图。见图1（封三）。
由图1（封三）可见，在第1～5、10、13～15、20～21和第24外显子中总计分布有30对同位点SNPs；在第9外显子中分布有1个肾源类非同位点SNP；在第6～8、11～12、16～19和22～23外显子中没有SNP分布；7个肾源类非同位点SNPs或12个其他组织源类非同位点SNPs分别分布在其3'端非编码序列中。
3 讨论
本研究应用生物信息学技术对存在于人preproEGF多肽mRNA/cDNA序列中的SNP及其分布情况进行了检索分析，结果得到共计106个位点及其SNPs分别分布于两类（肾源和其他组织源）mRNA/cDNA序列中。深入对比观察这些结果首先可见，分布于两类序列的42对共计84个SNPs因其相邻SNP间距相等而初步显示彼此的SNP位点及种类（RefSNP和亚SNP）皆具同一性；如果对比分析表1、2中的SNP位点也不难发现42对SNPs在两类mRNA/cDNA序列间之位点差距皆为16 bp，这说明分布于两类序列中的这些SNPs确实是位点及种类相同或同一的，本文将其简称为同位SNP。其次，观察分析结果也可见表1、2中有22个SNPs因其相邻SNP间距既不相等也不遵循两序列间相应位点之差距为16 bp的规律并且还数目不等地分别分布于各自归位的mRNA/cDNA序列中而表现出各自不同的位点差异性，对此本文称其为非同位SNP。
观察图1（封三）可见，分布在mRNA/cDNA序列编码区的SNPs绝大多数（97%）都是同位SNP对，这可能是为了维稳两类preproEGF多肽的遗传需要所决定的，因为依靠同位SNPs彼此间的高度同一性，方可确保由这些SNPs组成的密码子在分别编码两条蛋白多肽链时不会引起相应位点的氨基酸（AA）彼此出现差异从而改变蛋白多肽之结构和功能。然而，分布在序列编码区的个别SNP也有不是同位SNP的例外情况，例如，第9外显子内的015号SNP（R-1816）即不是同位SNP，而是一个属于肾源类的非同位SNP 。由于这个非同位SNP是位于蛋白多肽编码区内，因而颇有可能令其编码的AA有别于其他组织源preproEGF多肽序列相应位点的AA。一方面造成肾源类preproEGF多肽在结构或生物学特性方面有别于其他组织源类preproEGF多肽；另一方面因为造成蛋白多肽的结构和功能改变而导致疾病发生。尽管有如此可能的风险，但由于这个非同位SNP所归位的第9外显子并不参与编码53个AA多肽的成熟EGF，因而不太可能对成熟EGF的结构和生物活性造成影响或带来改变。不过，由于第9外显子参与编码一段类似EGF的同源多肽和一段低密度脂蛋白（LDL）受体同源肽段，因而这个非同位SNP还是有可能影响到肾源类preproEGF多肽与其他组织源类preproEGF多肽出现结构和生物学特性差异的[1，10]。当然事实是否果真如此迄今仍缺乏直接的证据，不过已有相似的例子见于研究报道，研究发现，位于肾源类preproEGF多肽mRNA/cDNA序列第22外显子中的一个单核苷酸由C变成了T，也即C3209T，因而使得preproEGF多肽链第1070位AA也相应地从脯氨酸变成了亮AA，即P1070L；同时，该研究还发现由于这个AA的改变导致了肾源preproEGF多肽维持体内Mg2+平衡之生物学功能随之改变进而引发了低Mg2+血症[11]。此外，也有报道观察到：肾源preproEGF多肽加工生成成熟EGF的场所是位于细胞之外，而其他组织源（例如下颌下腺、胰腺、前列腺等组织）的preproEGF加工生成成熟EGF则是在细胞内完成的；反之，在颌下腺、胰腺和乳腺等组织，preproEGF可被剪切加工生成成熟的EGF，但是在肾脏，preproEGF则不被剪切加工生成EGF[1]。据此推测，两类preproEGF多肽之间所展示的这些生物学特性差异也许会有一些SNP的影响因素在里面。其次，观察图1（封三）也可见分布在mRNA/cDNA序列非编码区的SNPs大多不是同位而是非同位SNPs。然而，一个有趣的现象是这些非同位SNPs极少分布在序列5'端非编码区，而是大多集中分布在了3' 端非编码区，具体的分布情况是：在两类mRNA/cDNA序列之5'端非编码区可见肾源类或其他组织源类SNPs各自仅分布了1个非同位SNP；而在序列之3'端非编码区肾源类SNPs却集中分布有7个非同位SNPs，其他组织源类更是集中分布了12个非同位SNPs。至于这些非同位SNPs的集中分布对preproEGF多肽有何生物学意义目前还不十分清楚，不过如果依据DNA元素百科全书研究项目对非编码核酸序列之生物学功能的发现和理解并且结合这些非同位SNPs集中分布于3'端非编码区的具体情况考虑，推测这些非同位SNPs集中分布于3'端非编码区可能有利于调节preproEGF的组织特异性表达，也即可能与preproEGF的表达调控有关[12]。
与在基因组序列的分布相比较，SNPs在preproEGF多肽mRNA/cDNA序列中之分布显示出较为明确的差异和不甚清晰的相似之处。首先，差异表现在SNPs的种类和数量方面。具体地说，也即分布于preproEGF基因组序列的SNPs包含有近35%的亚SNPs和65%的RefSNPs；而在两类mRNA/cDNA序列内，其所包含的亚SNPs却很少（仅占比SNPs约8%），绝大多数为RefSNPs（占比SNPs约92%）。其次，粗看表1、2结果感觉SNPs在mRNA/cDNA序列中的分布杂乱无章而与其在基因组序列中的分布规律毫无共通之处，然而细致观察却可见到SNPs在这两种序列中的分布仍有些许相似之处，具体表现在：①如果以200 bp相邻SNP间距划线为界即可见有少数SNPs（相邻间距>200 bp）是呈不均等散布于mRNA/cDNA序列中的；②SNPs在1～24外显子区段呈现出以外显子6～8、11～12、16～19和22～23为间隔而集合分布在第1～5、10、13～15、20～21和第24外显子中的特征也与其在基因组序列中呈富集丛簇分布的特征颇为相似[5]。此外，总观图1（封三）的SNPs分布还可见其在mRNA/cDNA序列中有一个从5'端往3'端逐渐密集分布以至紧密排列的特征，不过其生物学意义尚待研究。
合并表1、2所列资信绘制而成的SNPs分布图令其在两类preproEGF多肽mRNA/cDNA序列中之分布情形显得较为直观简明，易于理解，可为SNP与疾病的相关性研究提供便捷之信息支撑，对其他医学应用和实验研究也具有参考价值。
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关键词：生物信息学；教材；师范院校
20世纪80年代末以来，生物信息学以惊人的发展速度，获得了很多突破性成就，正日益成为生命科学在21世纪发展的核心内容。对于未来生物科学中坚力量的现代生物科学工作者而言，掌握生物信息学的相关知识尤为重要。
作为一门新兴的课程，生物信息学课程在全国很多高等院校都已经开设，并进行了一些卓有成效的探索和改革。我们结合自身的教学实践和相关学校的教学现状，对师范院校生物信息学课程教学内容、师资力量、教学模式和方法、跨学科合作、教学实践实施情况等方面的现状进行了积极分析和思考。目前，师范院校生物信息学教学的现状如下。
一、教学内容陈旧、教学资源缺乏
生物信息学是一门新兴的学科，在高等院校开设时间较晚，我国对生物信息学专业精品课程的建设方面投入不够，成熟的生物信息学教学大纲、教案、多媒体课件、教学视频和习题等教学资源稀少。目前，市场上也缺乏相关的生物信息学教学多媒体课件和音像制品辅导材料等相关产品，造成生物信息学教学资源匮乏的现状。
目前师范院校所用教材大多数是徐程主编的《生物信息与数据处理》，蒋彦等编著的《基础生物信息学及应用》等几种不同版本的教材。这些教材在知识性、科学性和系统性方面还行，但是在教学内容的新颖性、时效性和实践性以及生物相关背景的介绍和对师范院校的适用性等方面有所欠缺。生物信息学的知识日新月异，新的数据库、新的软件、新的算法层出不穷，而生物信息学的课堂往往不能及时地将最新进展呈现给学生，导致课堂内容陈旧，不利于学生的发展和对生物信息知识的合理掌握，从而影响了生物信息学教学的质量。
二、师资力量缺乏
生物信息学是一门新兴的交叉学科，需要熟练掌握计算机与生物学知识的老师来授课。然而，实际上，由于缺少生物信息学的专业教师，教授该学科的教师多为生物学其他课程兼任，这些老师往往缺乏专门的生物信息学训练，在知识的传授和应用方面存在欠缺。与生物信息学教学要求存在着较大的差距，不能很好地满足教学大纲的要求。另外，师范院校通常将生物信息学作为选修课来开设，该课程在专业建设和人才培养方案中的地位偏低，造成相关部门对师资培养不够重视。
三、教学模式和方法落后
由于生物信息学课程涉及大量的数据库和软件知识，教师普遍采用多媒体教学。而多媒体课件的容量通常很大，学生忙于笔记，难以把握重难点。同时，幻灯片展示的知识点犹如放电影一般一闪而过，学生没有足够的时间思考和消化，跟不上教师的进度。教师进行多媒体教学时，往往是一堂课上从头讲到尾，语调缺乏抑扬顿挫，没有起伏，学生很容易昏昏欲睡。因此，教师虽然使用的是先进的教学工具，采用模式的却是传统的灌输式教学，只管埋头照本宣科，不管学生接收领悟多少。学生为了达到期末考试标准，只顾死记硬背，这样的教育让学生失去创新精神和主动思考的能力，失去对生物信息课程的兴趣。
四、缺乏与相关学科的合作交流
生物信息学实际上是生物学与计算机科学的交叉学科。然而一般高校往往只在生命科学学院开设生物信息学，由生物学老师来担任授课老师。由于对计算机科学知识的缺乏，导致生物专业教师对生物信息学课程很难深入开展；另一方面，计算机科学专业由于没有开设生物信息学课程，使学生不能了解到生物信息学的重要性，以及如何使计算机科学更快更好地发挥其在生物信息学中的作用。总的来说，生物信息学课程的建设欠缺相关学科的协作，不能有效地整合资源，不利于培养复合型人才。
五、缺乏实践教学内容
现有的生物信息学课程也有一些实践内容，但实践课时数少，内容相对简单，缺乏系统完善的实践过程。教师为学生讲授具体知识时，通常只通过多媒体课件演示操作，并没有为学生设置具体的动手操作步骤。使得学生对信息反馈迟钝，印象不深刻，不容易掌握方法。生物信息学实践教学并不需要价格昂贵的实验设备，只需要一网的电脑和一些相关的分析软件便可以进行实验。然而，目前的状况是，生物信息学课程中真正开展实践性教学的内容少之又少。
生物信息学的学习是一个长期积累的过程，教学水平的提高也需要在大量的教学实践中不断总结和完善。我们通过分析发现，在师范院校生物信息学教学中仍存在很多问题，其原因是多方面的，需要教学工作者进一步深入探讨并提出切实可行的策略。
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一、心理因素的分析
现代研究已证明：男生和女生的智能总的来说是相当的，这已成为一个不争的结论。然而造成女生高中阶段物理成绩不如男生的原因是什么？究其根本，造成这一严峻现实的原因主要是女生的心理问题，如兴趣差异、能力差异、性格差异等等。
1. 兴趣差异
心理学研究表明，学习兴趣的水平对学习效果有较大的影响，在一般情况下男女生学习物理兴趣是不同的。女生较富于情感，其活动往往多定向于人，男生的活动倾向比较集中于物（物理学是研究“物”的）。从幼年起女性的兴趣和注意中心就是人及其直接的日常生活方面，而使男性感兴趣的客体所赖以存在的空间却是无限的，男生乐于探究且比女生更擅长思考较复杂的问题，男生比女生对物理更感兴趣，学习主动性强一些；男生的好奇心比女生强，这种不同的学习兴趣自然要影响学习效果。这样，女生学习物理的态度就比较被动，遇到困难时往往信心不足，从而一定程度上影响了学习物理这门课程的积极性和主观能动性。
2. 能力差异
能力是在人的先天素质的基础上，通过后天实践的锻炼和学习发展起来的，而男女生在知觉、记忆、想象、语言和思维等方面，都表现有能力上的差异。男生智能更倾向于概括，因而他们能够较早地发展区分主次的能力。而女生在学习中虽然有较高的准确性，但缺乏整体性和对事物的总体把握。男生在阅读教材时对插图、实验装置、实验现象比较注意，而女生更多注意课本中的概念、规律等结论，对实验现象往往缺乏整体观念，动手时有部分女生又有胆怯感。物理学科是一门实验学科，物理概念及其规律是建立在实验的基础上，久而久之，女生学习物理的困难就比较明显，这也是女生学习物理感到困难的主观原因。男女生在思维发展上的差异，主要表现在深刻性、灵活性、逻辑性和批评性等方面。男生思维多倾向于抽象思维，在思维品质上，无论是思维的深刻性还是灵活性、逻辑性和批判性，一般男生大都优于女生。而在高中物理学习中，抽象思维多于静态思维，大部分女生对这一思维方式较难适应，从而对学习物理产生了思维上的困难。
3. 心理品质差异
女生情感细腻而缺乏自我肯定易受暗示，很在乎他人的评价，他人的一言一行都可能引起女生的注意，从而影响其自我评价。良好的人际关系应建立在心理相容的基础上，但女生往往具有戒备心理，心理上互不相容，一遇小事，双方的关系就往往表现为排斥和摩擦，人际关系较差。另外女生较易感情用事，常把许多精力耗在无谓的人际关系处理上，影响了学业。
4. 其它方面
性发育带来了困惑和不安。发育早的女孩怕人家议论，发育晚的则会为此不安，甚至担心有什么毛病，总之，不论高矮胖瘦，女生们多少都会有为体型变化而不安、焦虑，而男生则少了这些麻烦。
二、改进措施
1. 培养女生学习的兴趣，增强女生学好物理的自信心。
根据女生的心理特点，教师应注意到自己的作用，做到因材施教，对女生在学习上取得的成功的时候，教师应及时地给予表扬，使她们尝到成功的乐趣，这样既能促使她们产生进一步满足的愿望，又能树立自信自强的信念，并形成更高的满足需要的动力机制。教师在复习时可调整教学内容及方法、容量及深度。章节考试结果表明男女生成绩差异最大的是《动量》、《机械能》两章。在平时的教学中，还要多提问女生，多开展演示实验，组织兴趣小组。同时要通过多种方式和途径，全方位地真实地掌握女生的心理实情，以对症下药。这样就能提高女生学习物理的兴趣，产生积极的学习动力。
2. 注意教学的直观性。
高中物理在研究复杂物理现象时，为了使问题简化，经常只考虑其主要因素而忽略其次要因素，建立物理的模型，使物理概念和规律抽象化。例如，把物体当成质点来研究物体做匀变速直线运动时，不少女生对即时速度、加速度等物理量感到很抽象。我们可以通过气垫导轨和数字计数器测定滑块的既时速度和加速度，使学生能够通过具体的物理现象来建立物理概念，提高女生的变通能力和灵活性，使其克服悟性不够的缺点，让感性认识上升到理性认识。
3. 加强观察力的培养。
女生对周围的事物的观察往往缺乏针对性，缺乏整体观念。比如说，灯泡是大家很熟悉的，但很多女生都没有注意到灯泡的两个通电触脚，在用万用表测灯泡电阻的学生实验中，很多女生测灯头上两个卡脚间的电阻。再如变阻器的连接中，很多女生往往会连在上面或下面两个接线上使变阻器电阻为零或为定值电阻。
物理学是一门以实验为基础的科学，而实验活动的第一个特点就是有目的地观察。
三、结果分析与讨论
通过对策的实施，大部分女生的自信心、学习方法、学习物理兴趣大大增强，心理承受能力、组织活动能力、抽象思维能力得到加强，部分女生的人际关系不良、性情狐僻、怪异、猜疑、紧张焦虑症得到改善，大部分女生变得热情、开朗而富有朝气，钻研精神也大大提高。
这样就可以增强她们的自信心，避免形成自卑感，达到苏霍姆林斯基所言的“让每个孩子都能抬起头来走路”的教学境界，最终使学生得到全面发展。
综上所述，已初步得出了高中女生学习物理的成绩差异的心理因素和对策，探索出了女生心理问题在学习物理上的可行性路子，使高中女生的学习物理的心理素质得到了显著的提高，促进了她们学习物理的兴趣和信心。
参考文献：
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