时间:2023-09-28 16:01:32
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【关键词】 CDTK基因;视网膜母细胞瘤;自杀基因治疗;5FC;GCV
Abstract
AIM: To investigate the killing effects of tumor cells specific vector of suicide gene of CDglyTK driven by hTERT promoter on retinoblastoma Y79 cells in vitro.
METHODS:At first,the recombinant plasmid was transfered into Y79 cells with electroblot as a delivery system. RTPCR and Western blot analysis were used to determine the CDTK mRNA and protein expression in Y79 cells which had been transfected by pcDNA3.1CMV hTERT CDTK plasmid vector. The conversion efficiency of 5FC into 5FU in CDglyTKexpressing Y79 cells was measured by HPLC. The killing effects of double suicide genes on Y79 cells that treated with 5FC,GCV of different concentrations were determined by the method of MTT.
RESULTS:The expression of CDTK gene in Y79 cells was certificated by RTPCR and Western blot and a 59kD protein was obtaind which was equal to the sequence expection of CDTK gene. In MTT analysis,there was significant difference between transfected and nontransfected survival Y79 cells(P
CONCLUSION:The recombinant plasmid vector pcDNA3.1CMV hTERT CDTK can be transcribed and translated into CDTK fusion protein in Y79 cells.The transfer of the CDglyTK fusion gene into Y79 cells followed by the administration of 5FC or GCV can kill Y79 cells in vitro. The killing effect of two predrugs is stronger than that of one predrug.
KEYWORDS: CDglyTK gene; retinoblastoma;suicide gene therapy;5FC; GCV
自杀基因治疗是近年来肿瘤研究的热点领域之一,也是目前最有可能有效应用于临床的肿瘤基因治疗策略之一。构建安全高效的载体是基因治疗的关键。我们已经成功的构建了含有hTERT启动子的肿瘤特异性杀伤载体pcChCDTK[1]。我们将探讨该载体对人视网膜母细胞瘤Y79细胞在体外的作用。
1材料和方法
1.1材料
Y79细胞株[美国模式菌种收集中心(ATCC)];RPMI1640细胞培养基(Gibco);胎牛血清(Gibco);5FC,5FU,GCV(Sigma);Reverse Transcription system kit(Invitrogen);Trizol(Gibco); QIAfilterTM plasmid Maxi kit(Qiagen); Triton X100(CalBiochem); ECL试剂盒(Amersham pharmacia biotech); PVDF膜(Amersham pharmacia biotech);双丙烯酰胺(BioRad); MTT(Sigma);鼠TK mAb(QED公司);兔抗鼠IgG二抗(KPL公司);蛋白质Marker(上海生化试剂公司);实验所用引物 (上海生工生物工程有限公司):yCDrt:5’ACGCTGTGTTGTCGGTGAGAA3’;TKrt:5’CAC CACCACGCAACTGCTG3’;βactin F:5’CACCCTGAAGTA CCCCATCG3’;βactin R:5’TTGCCAATGGTGATGACCTG3’。
1.2方法
将经过证实的含有pcChCDTK质粒的JM109菌液0.2mL接种到200mL含50mg/L氨苄青霉素的LB培养基中,37℃,280r/min的摇床上培养16h,将菌液转移到离心瓶中。然后按照QIAfilterTMplasmid Maxi kit提供的步骤进行操作提取质粒pcChCDTK,干燥后,加无菌水溶解质粒300μL,用Duc 640分光光度计测定DNA含量,20℃分装保存。用RPMI1640培养液培养Y79细胞,每日在倒置相差显微镜下观察。Y79细胞悬浮生长,培养中细胞可聚集成团并沉集于培养瓶底部,当细胞基本铺满瓶底即可传代,按照1∶2~1∶4传代。将传代后的Y79细胞培养24h后,细胞进入对数生长期,即可用于电转化。未转染Y79细胞生长迅速,传代后培养24h后,细胞进入对数生长期。取上述进入对数生长期并基本铺满瓶底的细胞,在22℃,1000r/min的条件下,离心10min,收集细胞。用0.01mol/L PBS 10mL重悬细胞,取细胞悬液20μL,用细胞计数板计数,其余细胞在22℃,1000r/min条件下,离心10min,重新收集细胞;根据计数结果,用0.01mol/L PBS以6.25×109/L的密度重悬细胞。取800μL细胞重悬液加入到含有pcChCDTK质粒20μg的EP中,吹打混匀,然后转入0.4cm的电击杯中,以2kV,25μF的条件进行电击。电击后,迅速将电击产物分至已加入10mL 200mL/L胎牛血清的RPMI1640培养液的75cm2培养瓶中,置37℃,50mL/L CO2的细胞培养箱内培养。电转染后的Y79细胞生长与未转染细胞相似。倒置相差显微镜下见细胞悬浮生长,形状饱满,色泽鲜亮,聚集成团。
1.2.1 CDTK基因表达的检测
提取Y79细胞RNA;参照reverse transcription system kit进行RTPCR反应;取逆转录产物2μL作为模板,以yCDrt和TKrt为引物扩增CDTK,同时用βactin扩增引物作对照,RTPCR产物用8g/L琼脂糖凝胶跑胶检测。另取未转染的Y79细胞设为对照,同法处理。取转染48h和未转染的Y79细胞预处理;固定玻片;配制分离胶和堆积胶;上样;跑胶;转膜;封闭;加一抗;洗一抗;加二抗;洗二抗;显色;曝光。
1.2.2 5FU浓度的检测
人视网膜母细胞瘤细胞株Y79用含200mL/L胎牛血清RPMI1640培养液在37℃,50mL/L CO2细胞培养箱中正常培养。细胞在转染肿瘤特异性杀伤载体pcChCDTK前24h换液,调整细胞密度使之在转染时达基本铺满瓶底。将细胞在22℃,1000r/min的条件下,离心10min,收集细胞,用适当体积的无血清的RPMl1640培养液重悬,细胞计数,使之密度为6.25×109/L。取细胞悬液800μL加入自杀基因载体pcChCDTK 20μg,将其混匀,转入0.4cm的电击杯中,以2kV,25μF的条件进行电击。电击后,细胞接种入培养瓶中培养,24h后收集细胞并用1×PBS洗3次,然后用含200mL/L胎牛血清的RPMl1604培养液配成细胞悬液,以每孔2×105个细胞的浓度植入24孔板,每孔培养液体积1mL。24h后加入前体药物5FC(200mg/L)。在加5FC 24h后取其细胞上清,用高效液相色谱仪(HPLC)检测其5FU的浓度。配5FC及5FU标准品的浓度梯度做标准曲线。LC10A高效液相色谱仪;分析柱: Shimpack CLCODS(5μm,150mm×4.6mm,ID);预柱YWGODS(10μm,10mm×4.6mm,ID);流动相:甲醇/水(20/80);流速1mL/min;检测波长266nm;柱温37℃。10μL进样。
1.2.3前体药物对细胞毒性的检测
采用Western Blot技术检测新融合自杀基因CDTK在视网膜母细胞瘤Y79细胞中的蛋白质水平表达。人视网膜母细胞瘤细胞株Y79用含200mL/L胎牛血清RPMI1640培养液在37℃,50mL/L CO2细胞培养箱中正常培养。以2×105个细胞的密度将细胞接种到96孔板中培养,每孔体积200μL。24h后,加入不同浓度的前体药物100μL,即5FC以0,25,50,100,200,400,800mg/L;GCV以0,2,4,8,16,32,64mg/L加入96孔板。每个浓度梯度有4孔。留1孔不加细胞,只加培养液做空白对照孔。在37℃,50mL/L CO2的条件下,细胞不换液培养5d后,每孔加入(5g/L) MTT溶液20μL,37℃,继续孵育4h,终止培养,吸去培养上清液。每孔加入DMSO 150μL,振荡10min,使结晶物充分溶解。比色:选择490nm波长,在酶联免疫检测仪上调定各孔吸收值。以每天进行换液的细胞做对照,假设细胞存活率为100%,将其它各细胞孔的吸收值与其比较得出各处理组细胞的平均存活率。另视网膜母细胞瘤细胞在转染前24h换液,调整细胞密度使之在转染时达基本铺满培养瓶底。将pcChCDTK载体电转染Y79细胞。电击后,细胞接种入培养瓶中培养,24h后,收集细胞并用0.01mol/L PBS洗3次,然后用含200mL/L胎牛血清的RPMl1604培养液配成细胞悬液,以每孔2×105个的密度植入96孔板中培养,每孔体积200μL。24h后加入不同浓度的前体药物100μL,5FC+GCV以两药的对应浓度加入96孔板,每个浓度梯度有4孔。留一孔不加细胞,只加培养液做空白对照孔。然后用MTT法检测细胞存活率。统计学分析:所得数据用SPSS 11.5统计软件包进行统计,采用StudentNeuman Keuls(SNK)检验,以P
2结果
2.1 Y79细胞转染后CDTK基因的表达
RTPCR检测结果显示,转染组可见一403bp特异条带,与预期大小一致(图1)。而在未转染的对照组细胞中,未扩增出403bp特异条带。在两组中均扩增出作为内对照的βactin产物561bp条带。分析结果显示:大小为42kD的内参βactin蛋白条带在转染和未转染的Y79细胞中均可见,一个大小为59kD的条带,在转染了pcChCDTK载体的Y79细胞中可见,这与yCDTK基因序列分析的预期蛋白大小一致,为自杀基因yCDTK蛋白。未转染pcChCDTK的Y79细胞中则没有59kD的条带出现(图2)。
2.2 Y79细胞转染后5
FC转化效率 加5FC 24h后上清中5FU的浓度平均含量为169mg/L,5FC向5FU的转化效率约为84.5%。
2.3前体药物对Y79细胞的毒性
将生长良好的人视网膜母细胞瘤Y79细胞,按每孔2×105个细胞接种到96孔板中培养。加入不同浓度的前体药物5FC培养5d,平均细胞存活率分别为98.2%,94.7%,90.5%,88.2%,89.4%,86.4%和83.9%。SNK检验表明,各梯度间的细胞存活率存在显著性差异(P
2.4前体药物对用肿瘤杀伤载体转染的人视网膜母细胞瘤细胞的毒性检测
将电转了pcChCDTK的人视网膜母细胞瘤细胞,按相同的密度将细胞接种到96孔板中培养。加入不同浓度的前体药物5FC培养5d,平均细胞存活率分别为94.0%,91.6%,85.1%,80.0%,72.7%,69.9%和62.7%。SNK检验表明,各梯度间的细胞存活率存在显著性差异(P
3讨论
目前,相对于传统的视网膜母细胞瘤(retinoblastoma,RB)治疗方法而言,RB基因治疗不仅可以弥补光凝固治疗、光动力学治疗、温热治疗、冷冻治疗的应用局限性,而且不会产生诸如化学治疗、放射治疗的副作用,更不会因为眼球摘除所导致的致残性而造成患儿心理障碍影响生图1RTPCR产物凝胶电泳图 M:DL2000 Marker;1:转染组可见预期的CDTK(403bp)目的片段和βactin(561bp);2:未转染组;3:阴性对照。图2Western Blot检测CDTK的表达 A:1,2:βactin(42kD);B:1:转染pcChCDTK的Y79细胞,出现一条约59kD蛋白;2:未转染的Y79细胞。
存质量。因此,RB基因治疗的研究越来越为人们所重视,并且通过不同的治疗策略取得了一系列的研究进展。现阶段对RB基因治疗的研究主要集中在4种不同的基因上,包括自杀基因、抑癌基因、抗血管生成基因以及促凋亡基因。RB发生的分子机制还不是太清楚,而且与RB形成相关的抑癌基因凋亡诱导基因种类繁多,与肿瘤血管形成相关的诱导因子和抑制因子多种多样,且分子机制仍有待于进一步研究。我们选择双自杀基因CDTK作为目的基因,实施RB的自杀基因治疗。首先,自杀基因作为肿瘤基因治疗的候选基因,已经在多种肿瘤开展研究[27]。其表达产物和前体药物相互作用来实现肿瘤基因治疗的机制比较清楚。其次,自杀基因和前体药物相互作用产生的毒性物质能通过不同方式实现对邻近肿瘤细胞的旁杀效应,包括直接分泌到细胞外旁杀,或通过细胞间隙连接旁杀,或通过产生凋亡小体、免疫介导来实现旁杀。同时,目前的研究表明,自杀基因系统治疗RB是安全有效的[8]。我们设计的含有双自杀基因CDTK的载体通过电转染的方式导入了视网膜母细胞瘤细胞株Y79细胞。48h后,提取转染Y79细胞RNA,RTPCR的结果可见一403bp特异条带,与预期大小一致,显示双自杀基因CDTK在细胞中mRNA水平得到了表达。Western blot的结果也同样显示,载体转染的Y79细胞中,59kD的目的基因蛋白有明显的表达。这两个实验结果充分说明,我们构建的双自杀基因CDTK在靶细胞Y79中得到表达。先前的研究显示,被设计得的融合基因yCD/UPRT、大肠杆菌CDglyTK以及yCDglyTK具有最强的催化前体药物向细胞毒物转化的能力。我们通过HPLC检测5FU的浓度,上清中5FU的浓度平均含量为169mg/L,故5FC向5FU的转化效率约为84.5%,说明我们所构建的肿瘤特异性双自杀基因载体具有很强的催化前体药物向细胞毒性物质转化的能力。
双自杀基因疗法是将两种自杀基因整合在一起,通过载体转导进入肿瘤细胞,其在肿瘤细胞内表达的融合基因产物具备两种酶的活性。因此,双自杀基因疗法可以大大提高抑制肿瘤生长的功效,同时使得前体药物的用量减半。大量资料表明双前体药物对肿瘤细胞的杀伤作用要强于单前体药物。但也有资料显示双自杀基因之间可能存在拮抗效应。在体外实验中,单独加5FC的细胞杀伤最强,要高于5FC和GCV都加的组,而单独加GCV的细胞杀伤力最低, CD和TK之间没有协同作用,反而可能会相互干扰各自功能的运行。原因可能有两个方面:(1)可能是融合基因yCDglyTK在同时加5FC和GCV时,CD/5FC和TK/GCV两种系统的功能出现拮抗效应;(2)可能是在yCDglyTK融合基因中,由于某种原因,CD和TK的活性在这个融合基因中得到提高,使CD/5FC和TK/GCV两种系统的抑瘤能力同时或其中一种得到增强。当E.coli CD和HSV1 TK基因同时在一种细胞中表达时,会存在相互干扰作用。这种干扰作用的机制到目前还没搞清楚,但干扰作用可能不是发生在基因的转录期,而是在转录之后,TK介导的5FUMP的磷酸化会产生无毒的5FdUDP和5FdUTP,而不是毒性产物5FUDP和5FUTP,从而减低了CD/5FC的细胞毒性作用;或者CD介导的对GCV,ACV等的脱胺反应减低了TK/GCV系统的细胞毒性。yCD/UPRT基因中UPRT的酶活性与单独的UPRT酶活性大致相等,但是yCD/UPRT基因中的CD酶活性要高于单独CD酶活性100倍。这种酶活性的改变可能与这3种酶的蛋白质特性不同有关。加入不同浓度的前体药物5FC,GCV或5FC+GCV于电转了pcChCDTK的人视网膜母细胞瘤Y79细胞培养5d, SNK检验表明,与未转染的细胞对应浓度组比较,当5FC浓度达到100mg/L后各对应浓度平均细胞存活率组间均存在差异(PGCV >5FC。在本实验中,单前体药物对双自杀基因CDTK载体转染的Y79细胞均有杀伤作用,但双前体药物的杀伤作用要强于单前体药物。分析产生这种结果的原因,我们认为:(1)双自杀基因载体具有很强的催化前体药物向细胞毒物转化的能力;(2)这可能与我们加入的CMV增强子能大大促进hTERT启动子启动下游目的基因的表达有关,因为CMV增强子具有强大的增强转录能力,且没有组织特异性。
参考文献
1张永红,唐罗生,雷少波. hTERT启动的双自杀基因CDTK载体的构建.国际眼科杂志2009;9(10):18761880
2陈海金,黄宗海,苏国强,等.慢病毒介导的双自杀基因对大肠癌细胞的靶向杀伤作用.世界华人消化杂志2006;14(17):16811687
3陈海金,苏国强,黄宗海,等.慢病毒介导的双自杀基因对乳腺癌细胞的杀伤作用.广东医学2006;27(7):965967
4谭万龙,谢毅,吴元东,等.腺病毒介导融合双自杀基因治疗膀胱癌.南方医科大学学报2006;26(5):594597
5陈祖兵,梁力建.腺病毒载体介导的双自杀基因对人胆管癌细胞QBC939的体外杀伤实验.中华肝胆外科杂志2006;12(4):257259
6黄嘉凌,刘艳燕,刘然义,等.肝癌特异性HSVTK/CD基因表达质粒的构建及其杀伤活性.中山大学学报(医学科学版)2005;26(2):142145
关键词:非小细胞肺癌;中医;西医;治疗进展;展望
中图分类号:R273文献标识码:A
文章编号:1007-2349(2011)11-0085-03
非小细胞型肺癌(nonsmallcelllungcancer,简称NSCLC),是发生于肺部的常见癌症。根据病理学组织结构,可分为鳞癌、腺癌、大细胞癌等不同类型,约占肺癌总数的80~85%[1]。目前治疗以西医治疗为主,其中以手术治疗、放疗、化疗为主要治疗手段。中医作为辅助疗法不但可减轻放、化疗所致的毒副作用,而且有利于放、化疗顺利进行,在延长生存期等方面取得了较为满意的疗效。从总体治疗效果看,NSCLC的临床治疗已取得很大进展。本文就NSCLC的临床中西医治疗进展与展望作一综述。
1外科治疗
11一般手术治疗一般手术治疗仍然是目前治疗早期非小细胞肺癌最理想的方法。手术方法有肺叶切除、一侧全肺切除、袖式肺叶切除、气管隆凸再造、气管-肺动脉成形术等手术方法。同时需高度重视淋巴结清扫,只有通过系统肺门和纵隔淋巴结清扫才能达到完全切除和标准分期的目的。
12微创胸外科手术治疗目前,肺癌微创外科技术主要有3种手术方式,即视频辅助胸腔镜手术(video-assistedthoracoscopicsurgery,VATS)、机器人辅助胸腔镜手术(robot-assistedthoracoscopicsurgery,RATS)和保护胸壁肌肉的小切口开胸手术(muscle-sparingminithoracotomy,MSMT)。(1)VATS:目前中国多家胸外科中心已开展VATS肺癌切除术,在2008年第8次全国胸心血管外科学术会议上,华西医院刘伦旭介绍了更具有操作性、更加规范的“单向式胸腔镜肺叶切除术”,标志着中国VATS肺癌切除术的成熟。(2)RATS:近年,机器人已被引入外科手术中,这揭示了未来胸外科的发展趋势和方向[2]。2006年美国纽约纪念医院[3]报告了34例RATS肺叶切除的临床资料,无手术死亡,4例(12%)中转开胸,平均清除4组淋巴结,中位手术时间218min,中位胸腔引流时间3d,中位住院时间45d。(3)MSMT:随着器械外科技术的进步和小切口下手术操作技巧的提高,经MSMT可方便地施行与传统开胸手术相同的解剖性肺切除和系统淋巴结清扫,已能对绝大多数具备手术适应证的肺癌实施根治性切除,获得与传统后外侧切口肺癌切除术相同的治疗结果。
2化疗
目前化疗方案大致可分为两类:以铂类药物为基础的双药联合方案和不含铂类药物的方案。(1)以铂类药物为基础的双药联合方案是目前治疗NSCLC较常用的一种手段,药物的组合方式也有多种,铂类联合新药是目前治疗的首选方案[4]。对于有良好预后因素的晚期NSCLC患者采用联合顺铂与健泽、紫杉醇、异长春花碱化疗取得了令人满意的有效率;对于没有良好预后因素或老年患者,采用异长春花碱、健泽或紫杉醇单药治疗更为合适[5]。(2)不含铂类药物的方案药物主要是紫杉醇、多西他赛、泰素帝、吉西他滨等。目前最引人注目的方法是“TXT”(泰索帝)75mg/m2(毫克每平方米体表面积)单一药物治疗[6]。
3放疗
根据目前的研究,放疗可分为术前放疗、术中放疗和术后放疗3种方法。术前放疗的目的为清除手术区域以外的亚临床病变,减小肿瘤体积以及相邻组织之间的浸润,减少局部种植和转移的机会,以提高切除率和生存率。但是临床实践显示上述目的未能达到,并没有使患者受益,临床上已不常规采用[7]。术中放疗的目的是降低局部复发率,是近年发展的在手术残留部位以电子线进行的一次性大剂量(15gy~25gy)照射,手术伤口愈合后再行体外高能放疗。术后放射治疗可提高生存率,对于手术中癌肿组织未能全部切除或支气管断端残留癌浸润的病例可放置金属标记行放疗。
4分子靶向治疗
分子靶向治疗比传统的化疗具有更高的选择性,毒副作用小,是今后肿瘤治疗的新趋势[8]。目前临床应用的分子靶向治疗药物主要有以下3类:(1)作用于表皮生长因子受体(EGFR)酪氨酸激酶抑制剂是一种跨膜蛋白,为原癌基因EerB1(Her21)的表达物。这类药物包括易瑞沙和埃罗替尼等多种药物。(2)作用于血管生成的靶向药物是一种重组人源化抗血管内皮生长因子单克隆抗体,由培养在含庆大霉素培养基中的中国仓鼠卵巢哺乳细胞表达体系生产。这类药物主要有贝伐单抗等。(3)多靶点治疗药物是一种口服多靶点治疗药物,能选择性地抑制血管内皮生长因子依赖的肿瘤血管形成,而且对表皮生长因子受体也有一定抑制作用。这类药物有ZD6474等。
5免疫治疗
51主动免疫疗法主要有非特异性主动免疫疗法和特异性主动免疫疗法。(1)非特异性主动免疫疗法:目前主要应用具有免疫调节作用的刺激因子通过非特异性的作用激发机体的免疫系统,增强抗肿瘤的免疫应答。如卡介苗、短小棒状杆菌、左旋咪唑等,也可用细胞因子如白介素-2、白介素-4、干扰素、肿瘤坏死因子等。但由于肺癌的肿瘤抗原性不强,目前这种治疗难以取得明显效果。(2)特异性主动免疫疗法:随着对肿瘤免疫研究的深入,肿瘤疫苗和抗独特性抗体作为疫苗的发现使特异性主动免疫疗法成为可能[9]。某些抗独特性抗体与抗体上的抗原相关位点结合,能够模拟外来抗原,作为免疫治疗中替代性抗原。
52被动免疫疗法主要有过继免疫疗法和抗体疗法。(1)过继免疫疗法:目前肺癌的过继免疫疗法可以应用淋巴因子激活的杀伤细胞(LAK)输入体内或局部应用于癌性胸水,对延缓病情的发展有一定的效果,但单独应用治疗效果不佳。还可以应用肿瘤浸润性淋巴细胞(TIL),通过基因修饰的TIL进行治疗。实践证明TIL的疗效比LAK要更好。(2)抗体疗法:目前抗体疗法正成为肺癌的另一研究热点,它已成为肺癌综合治疗的一部分。运用相应的单克隆抗体与异常表达的癌基因产物结合可以阻断癌细胞的异常信号传导通路,从而阻止癌症的发展[10]。
6介入治疗
目前介入治疗在NSCLC应用的方法主要有两种,即经支气管动脉灌注化疗和支气管栓塞治疗。经支气管动脉灌注化疗可有效提高肿瘤局部药物浓度,提高抗癌药物的解毒作用,同时又可以减少或阻断肿瘤的血供,使其缩小、坏死。支气管栓塞治疗可通过介入放支架解除肿瘤引起的中心气道狭窄或阻塞,对继发于肺癌的上腔静脉综合征患者血管内置人支架是较好的方法。
7基因治疗
基因治疗在该病所应用的方法主要有[11]诱导特异性免疫的基因治疗和直接作用的基因治疗两种。诱导特异性免疫的基因治疗即输送生物活性基因来改变癌细胞的局部免疫环境,增加癌细胞的免疫原性和T细胞的反应性,改善抗原提呈和提供缺失的旁分泌。由于免疫性诱导是遗传性系统性的,同时靶子来源于肿瘤抗原,因此所诱导的免疫性具有潜在发现和杀死没有经过基因修改的肿瘤细胞。这一特点可能对以远处转移为主要问题的肺癌具有重要意义。直接作用的基因治疗主要有抑癌基因的治疗、药敏感性基因治疗和反义cDNA和寡核苷酸技术3种方法。
8中医药治疗
中医学侧重辨证施治,从整体调节入手,目前中医药在治疗肺癌中,特别是在NSCLC的防治方面主要有以下作用:(1)防治手术、放疗、化疗副反应;(2)配合手术、放疗、化疗减毒增效;(3)在抗非小细胞肺癌复发和转移的综合治疗中起很重要的作用;(4)不能手术、放疗,不宜再化疗的肺癌患者,中医起主导作用,即改善症状、提高生存质量、延长生存期[12]。
81病因病机中医学认为,肺癌属“肺积”“痞癖”“咳嗽”“咯血”“胸痛”等范畴,病位在肺。学者们对其病因病机虽然有不同的认识,但无外乎正气虚损和邪毒内积两个方面,本病病变部位在肺,与脾、肾有关,病理因素主要为气滞、痰浊、瘀血、热毒,病理性质为本虚标实,虚实错杂。在治疗过程中,扶正培本为其关键。
刘丽坤等[13]认为,肺癌的基本病机为正虚邪实。正虚是肺癌发生的基础,是复发、转移的关键,其中肺阴亏虚贯穿疾病的始终,痰瘀毒结是肺癌的主要病理表现。刘嘉湘认为肺癌总属本虚标实,由于正气先伤,邪气得以乘虚而入,聚积于肺,导致气滞血瘀、聚液为痰、痰瘀交阻而渐成肿块。高萍等认为放化疗副反应是毒邪内侵,损害肝脾肾等脏腑功能,耗伤机体气血津液,导致气血阴阳的失调与缺失。
82辨证分型中医将肺癌看作是全身性疾病的一个局部表现,主要根据症状和体征对肺癌进行辨证分型,治疗上强调全面调整人体机能。目前主要依据阴阳盛衰、气血的虚实、脏腑病机以及邪毒性质进行归类分型。这些证型基本反映了肺癌病情发展不同阶段的一些规律。刘嘉湘对405例非小细胞肺癌病例进行研究,其中阴虚和气阴两虚型占肺癌的726%,指出肺癌的病机特点以阴虚和气阴两虚为主。杨国旺等将肺癌划分为气虚、阴虚、阳虚、血虚、痰湿、血瘀、毒热7个基本证型。李忠等研究发现以气阴两虚及痰瘀互阻证型最为常见,其他依次为脾虚痰湿、肺脾气虚、气虚血瘀、痰湿阻滞等。孙士玲分为肺脾气虚、肺,胃阴虚、肺热痰湿、气滞血瘀型。
83中成药中医药作为一个辅助疗法,在非小细胞肺癌的治疗中起到了很大的作用。随着中药制剂现代化研究,研制成了很多中成药,有很好的临床疗效。目前临床上使用的口服中成药有固本消瘤胶囊、乾坤胶囊、平消胶囊、抗瘤冲剂、仙露冲剂、中成药鹤蟾片、参一胶囊等。治疗NSCLC的中药静脉制剂主要有康莱特注射液、参麦注射液、丹参注射液、艾迪注射液、华蟾素、榄香烯、岩舒注射液等。
9回顾与展望
非小细胞肺癌的手术、放疗、化疗和生物治疗等在临床治疗上已经取得了很大的进步,但是治疗效果仍不能令人满意。中医药作为一个补充治疗手段和方法正起到越来越重要的作用。中医的整体观从大局出发,提倡提高机体正气抗邪,防止病情进展,正弥补了西医重局部的不足。中医药治疗肺癌的疗效以病灶稳定率较高、生存期较长、改善生活质量较好为主要特点,在抗复发转移,减负增效方面有一定的优势,对于已无放化疗机会晚期肺癌患者,中医药治疗是缓解疾苦的主要手段。但是中医治疗在很多方面还不完善,比如辨证分型缺乏统一的认识,临床应用个案报道数量较多,缺乏大样本、多因素的观察,循证医学证据并不充分等。
笔者认为目前西医治疗一方面微创手术研究是未来外科手术的发展方向,另一方面靶向治疗、免疫治疗和基因治疗都是肺癌多学科治疗中新的研究和应用热点,日益受到重视,是以后发展的方向。要注意提高药物疗效,降低毒副作用,延长患者(尤其是晚期肺癌患者)的生存期。中医治疗应从扶正祛邪,整体调节入手,应特别重视调补肺脏功能兼顾调整五脏功能。具体来说,整体方面要调理饮食,注意饮食平衡;调理药物,注意药物之间的平衡,勿太过不及;调理五脏功能,勿偏盛偏衰。局部方面要注意调整肺脏本身的功能和调整脾胃功能。中医认为“人以胃气为本”、“脾胃为后天之本,为气血生化之源”,脾胃功能好坏对疾病的预防和治疗都有很重要的作用,尤其在肺癌的防治中更是具有重要价值。未来该病的治疗必将走上一条中西医互补的道路,因而希望能够多学科配合、大胆摸索、反复实践,更好的发挥中西医结合在NSCLC预防治疗中的特色和优势,从而对人类防治NSCLC整体水平的提高起到积极地推动作用。
参考文献:
[1]PearsonFGNon-smallcelllungcancer:roleofsurgeryforstageⅠ-Ⅲ[J]Chest,1999,11(6):500~503
[2]聂强,贲晓松,张国淳,等早期非小细胞肺癌的治疗[N].中国医学论坛报,20070208,B04,肿瘤
[3]ParkBJ,FloresRM,RuschVWRoboticassistanceforvideo-assistedthoracicsurgicallobectomy:techniqueandinitialresults[J]JThoracCardiovascSurg,2006,131:54~59
[4]黄赐汀非小细胞肺癌治疗现状与未来策略[J]临床荟萃,2004,19(24):1431~1432
[5]刘红,张艳华非小细胞肺癌的药物治疗进展[J]中国药学杂志,2005,40(10):725~729
[6]SheplerdFA,DanceyJ,RamlauR,etalProspectiverandomizedtrialofdocetaxelversusbestsupportivecareinpatientswithnon-smallcelllungcancerpreviovlytreatedwithplatimumbasedchemotherapy[J]JClinOncol,2000,18(10):2095~2103
[7]孙威非小细胞肺癌治疗进展[J]中华现代外科学杂志,2005,2(1):60~62
[8]张子瑾,程刚分子靶向药物治疗非小细胞肺癌的临床研究进展[J]中国新药杂志,2005,14(10):1141~1145
[9]Bhattacharya-CharterjeeM,CharteeeSK,FoonKATheantiidiotypevaccinesforimmunotherapy[J]CurrOpinMolTher,2001,3(1):63269
[10]LangerCJRoleoftargetedtherapyinnon-smallcelllungcancer:hypeorhope[J]ExpertRevAnticancerTher,2003,3(4):443~455
[11]于甬华,李晓梅局部晚期非小细胞肺癌治疗进展辅助治疗[J]山东医药,2003,43(3):60~61
[12]张洪亮,马金丽肺癌[J]新疆中医药,2004,22(6):72~75
[13]刘丽坤,李宜放,王星肺癌的病机及治法探讨[J]中国中医基础医学杂志,2004,10(5):75~79
[14]孙建立刘嘉湘教授研究肺癌中医诊治规律的思路探讨[J]上海中医药杂志,2002,(9):10~11
[15]高萍,王祥麟芪瑞扶正冲剂治疗恶性肿瘤放疗化疗后白细胞减少30例[J]中医杂志,2003,44(4):257
[16]孙建立刘嘉湘教授治疗原发性非小细胞肺癌辨证和用药规律分析[J]第三届国际中医、中西医结合肿瘤学术交流大会暨第十二届全国中西医结合肿瘤学术大会,2010:691~695
[17]杨国旺,王笑民,韩冬,等中医综合疗法治疗晚期非小细胞肺癌临床研究[J]中国中医药信息杂志,2005,12(9):11
[18]李忠,陈信义,姜苗肿癌中医临床研究进展与用药思路[J]中国医药学报,2004,19(3):176
[19]孙士玲,杨丽萍中西医结合治疗晚期非小细胞肺癌疗效观察[J]河南中医,2004,24(3):52
【摘要】 目的: 探讨黏着斑激酶(FAK)表达水平对结直肠癌细胞增殖及运动的影响。方法: 针对FAK基因不同靶点设计siRNA序列, 构建siRNA重组子, 转染Caco2细胞, 以RTPCR和免疫细胞化学方法检测FAK mRNA和蛋白表达变化及时间效应, 同时检测FAK基因敲低对Caco2细胞的凋亡、 增殖及迁移的影响。结果: FAK siRNA导入Caco2细胞后, FAK mRNA和蛋白表达水平明显下调, 细胞增殖及迁移能力受抑, 呈时间依赖关系, FAK mRNA水平下调在转染后48 h达到最大。结论: FAK siRNA可有效抑制靶基因表达, FAK表达水平下调后Caco2细胞的增殖及运动明显受抑制。
【关键词】 小干扰RNA; 结直肠癌; FAK; 细胞增殖; 细胞运动
[Abstract] AIM: To investigate the effect of siRNA targeting FAK gene on proliferation and motility of colorectal cancer. METHODS: Recombinant plasmids that produced siRNAs targeting FAK were designed and cloned, then transfected into Caco2 cells. The changes of FAK expression levels were examined by RTPCR and immunocytochemistry. The effects of FAK gene knockdown on apoptotic morphological changes, proliferation, and motility were investigated. RESULTS: Recombinant plasmids targeting FAK were successfully constructed, FAK mRNA and protein level was silenced in Caco2 cells significantly. The inhibition of mRNA level was achieved maximal at 48 h post transfection with time dependent. The ability of proliferation and motility of Caco2 cells were significantly decreased. CONCLUSION: Plasmidmediated FAK siRNA could inhibit FAK gene expression. The proliferation, motility and apoptosis were inhibited effectively, which suggested that FAK expression is closely associated with the proliferation, motility and apoptosis, etc. The results may be used as the reference for gene therapy of colorectal cancer.
[Keywords]small interfering RNA; colorectal cancer; FAK; cell proliferation; cell motility
近年来以黏附相关因子为靶点的治疗成为基因治疗研究的新策略[1], 黏着斑激酶(focal adhesion kinase, FAK)是近年来发现的细胞黏附介导的信号通路的重要因子, 作为胞内信号蛋白酪氨酸激酶, 于1992年被独立鉴定为Src癌基因的底物。FAK的相对分子质量(Mr)为125 000, 定位于人染色体8q24, 与cmyc基因座接近, 此基因座在人癌细胞中往往被激活而强化[2]。FAK作为信号转导的关键分子, 可传递由胞外到胞内的多种信号, 其在结肠癌中表达升高而在正常组织细胞中表达呈弱阳性的特点开始引起研究人员的关注[3]。有研究显示, FAK基因在结直肠癌组织中表达升高[4], 并与癌细胞增殖、 侵袭转移密切相关, 但作用机制还不明确。本实验将靶向FAK基因的siRNA表达载体导入Caco2细胞, 探索FAK siRNA对结直肠癌细胞增殖和迁移的影响并初步探讨其作用机制, 为结直肠癌基因治疗积累实验资料。
1 材料和方法
1.1 材料 人结直肠癌细胞株Caco2购于美国ATCC。重组质粒pU6H1GFP/FAKsiRNA为本实验室设计、 百奥生物技术有限公司(南通)构建, 大小为5.5 kb, 经测序正确。限制性内切酶Hind Ⅲ购自NEB公司。脂质体Lipofectamine 2000、 TRIzol试剂均为美国Invitrogen公司产品。RPMI1640培养基购自美国Gibco公司。胎牛血清购自杭州四季青生物工程材料有限公司。四甲基偶氮唑蓝(MTT)购自美国Amresco公司。RT007 AMV反转录酶购自杭州博日科技有限公司。FAK、 GAPDH引物由北京奥科生物技术有限责任公司合成。针对FAK的单克隆抗体(mAb)购自Santa Cruz公司。SP免疫组化试剂盒购自北京博奥森生物技术有限公司。Hoechst 33258购自南京凯基基因有限公司。其他试剂均为国产分析纯。
1.2 方法
1.2.1 siRNA的设计及构建 利用Ambion siRNA在线软件设计了2条针对FAK的siRNA: siFAK1: 5′GGGCAGACGAGACCACACTGA3′; siFAK2: 5′GAAATGGAAGAAGATCAGCGCT3′; 错义对照序列siRNASCR: 5′GCATCTAAGGTATCGTTGTGGCTC3′。经Blast比对证实与人其它基因无同源性后构建合成siRNA表达载体, 双启动子U6和H1之间插入人FAK及错义siRNA靶序列。
1.2.2 细胞转染 于6孔培养板, 将Caco2细胞接种于无抗生素、 含100 mL/L胎牛血清的RPMI1640培养液, 细胞接种密度: 2×105/孔, 饱和湿度培养24 h。参照Lipofectamine 2000说明书进行转染优化, 转染后6 h更换完全培养基。实验分为: 正常对照组(未转染的Caco2)、 错义siRNASCR组(非特异性siRNA转染)、 干扰组siFAK1、 siFAK2。
1.2.3 GFP表达检测及转染效率评价 转染后细胞于激发波长为488 nm的荧光倒置显微镜下检测GFP的表达情况。以放大100倍的视野为标准, 计5个视野表达绿色荧光的细胞数和总细胞数, 求GFP表达率: GFP表达率=发绿色荧光细胞数/细胞总数×100%。
1.2.4 细胞凋亡形态学检测 取对数生长期细胞以2×105/孔接种于铺有无菌盖玻片的6孔板中, 每组爬片4张, 转染48 h后弃培养液, PBS洗3次, 40 g/L多聚甲醛4℃固定15 min, PBS洗3次, 吸净液体, 每孔加入200 μL Hoeschst 33258工作液, 避光孵育10 min, PBS漂洗封片, 荧光显微镜下随机选取高倍视野进行拍照, 激发光波长为365 nm。
1.2.5 RTPCR检测 收集转染后24、 48、 72、 96 h细胞, 各组细胞总RNA按TRIzol试剂说明书提取。将总RNA(0.5 μg)行10 μL反转录体系。取cDNA再进行25 μL PCR反应。PCR循环参数为: 95℃预变性2 min; 94℃变性40 s, 46℃退火40 s, 72℃延伸1 min, 共28个循环(GAPDH: 18个循环), 于72℃延伸10 min。FAK上游引物: 5′GCGTCTAATCCGACAGCA3′, 下游引物: 5′GCCGACTTCCTTCACCAT3′, 扩增产物为445 bp; 内参GAPDH上游引物: 5′AATCCCATCACCATCTTCCA3′, 下游引物: 5′CCTGCTTCACCACCTTCTTG3′, 扩增产物为580 bp。各取5 μL扩增产物, 经15 g/L琼脂糖凝胶电泳, 凝胶成像仪下观察结果及照相, BandScan 5.0进行条带分析, 检测各组FAK与GAPDH的灰度比值表示FAK mRNA表达水平变化, 比值越高说明目的基因表达越高。
1.2.6 细胞增殖检测 调整细胞密度为6 000个/孔, 接种至96孔板, 设Blank组(只加完全RPMI1640培养液)、 siRNASCR组、 正常对照组、 干扰组(siFAK1、 siFAK2), 每组每个时间点设6个复孔。培养24 h后弃上清, 进行转染(脂质体: 0.5 μL, DNA: 0.2 μg)。于孵箱中继续培养24、 48、 72、 96 h后每孔加入MTT(1 g/L)15 L, 37℃、 50 mL/L CO2避光孵育5 h, 再加入100 μL DMSO振荡10 min, 酶标仪562 nm处测定各孔A值。生长抑制率=(1-处理组平均A值)/正常对照组平均A值×100%。
1.2.7 细胞迁移检测 于6孔板内按上述方法进行转染, 培养24 h后用外接真空泵的1 mL移液枪头(直径1.5 mm)垂直于6孔板板底分别打孔, PBS清洗2次, 更换完全培养液。分组同1.2.2, 40倍倒置显微镜下照相。于转染后48、 72、 96、 120 h继续照相, Gene Tools软件测定每孔各时间点面积。迁移率=(1-该时间点损伤面积)/原始损伤面积×100%。
1.2.8 免疫细胞化学检测 将细胞接种于铺有无菌盖玻片的6孔板中(1.5×105/孔), 每组爬片4张。设阴性对照组(PBS代替一抗)、 siRNASCR组、 正常对照组、 siFAK1和siFAK2共5组。转染48 h后取盖玻片用SP试剂盒检测, FAK mAb稀释度为1∶300, 避光条件下, DAB显色, 三蒸水冲洗停显, 梯度酒精脱水, 二甲苯透明, 取出盖玻片置于载玻片上, 胞质出现棕褐色为阳性染色。中性树胶封片后, 每组随机选取10个高倍视野(×200), 进行图像采集。
1.2.9 统计学分析 数据以x±s表示, 采用SPSS15.0软件进行方差分析。P
2 结果
2.1 重组质粒pU6H1GFP酶切鉴定 用Omega无内毒素质粒小提试剂盒扩增并纯化质粒, 经Hind Ⅲ 酶切鉴定, 可见质粒可被切割成大约5.5 kb的线性片段, 结果完全正确(图1)。
2.2 转染效率 经优化的脂质体条件转染后, GFP表达率为(44.59±2.71)%。
2.3 细胞凋亡的形态学观察 经Hoechst 33258染色可见正常对照组细胞染色质为弥漫均匀的低强度荧光, 无明显凋亡特征(图2A); 经siFAK1和siFAK2组转染细胞48 h后, 细胞表现出典型的凋亡形态学变化, 胞核呈浓染致密的固缩形态、 断裂成块、 呈颗粒状亮蓝色荧光, 且有少量凋亡小体出现(图2D、 E中箭头所示)。脂质体组及siRNASCR组均没有出现明显的凋亡形态学改变(图2B、 C)。因此可得出脂质体试剂及pU6H1GFP载体对转染无明显影响, 排除假阳性的干扰。
2.4 FAK mRNA表达变化 转染Caco2细胞于24、 48、 72、 96 h后检测siRNA敲低FAK mRNA水平表达的时间效应关系, 并确定敲低效果最好的1条序列。RTPCR结果显示, 各组内相应内参GAPDH的条带基本一致, siFAK1和siFAK2组FAK mRNA水平低于正常组和siRNASCR组, 且敲低效应在转染后24~48 h范围内呈时间依赖性降低, 至48 h降到最低(P
2.5 细胞增殖状况 MTT法检测表明, siFAK1和siFAK2组细胞增殖抑制率明显增加(图4)。与正常对照组相比, siFAK1和siFAK2对细胞增殖的抑制率在转染后24~72 h均有统计学意义(P
2.6 细胞迁移状况 与正常组相比, 特异性siFAK1、 siFAK2组使Caco2细胞的迁移率明显降低(P
2.7 FAK蛋白表达变化 免疫细胞化学方法检测结果显示, 正常组FAK表达多位于胞质, 呈棕褐色, 强阳性表达, 而siFAK1、 siFAK2组细胞中FAK蛋白的表达明显减弱(图6)。ImagePro Plus 6.0图像分析各组的A值, 转染后48 h siRNASCR组、 正常对照组、 siFAK1及siFAK2光密度分析结果分别为0.223±0.006、 0.254±0.002、 0.059±0.006、 0.079±0.008。可见转染后48 h两个干扰组的蛋白表达明显被抑制(P
3 讨论
FAK作为Src癌基因的底物, 位于整合素富集的黏着斑处, 与多种信号分子相互作用, 介导多种细胞表面受体激活及信号传输来调控细胞骨架组建、 细胞增殖、 凋亡及存活、 细胞转移及入侵等, 最终参与肿瘤的发生。有研究表明, 在正常结直肠上皮细胞中FAK表达呈弱阳性或阴性[5], 这与维持上皮细胞的生理功能是不可缺少的; 而在结直肠癌相关的细胞中FAK表达明显升高, 说明其表达上调可能是结直肠癌具有恶性表型的早期事件。因此, FAK作为肿瘤发生进程相关的关键分子可能成为肿瘤治疗的靶点, 而抑制FAK的表达则有望成为肿瘤基因治疗的新热点。针对FAK基因的反义寡核苷酸治疗结直肠癌的研究已有报道[6]。RNAi是近年来快速发展的一种高效的基因沉默技术, 并作为一种关键技术应用于抗肿瘤、 基因功能研究[7]。
本实验以Caco2细胞为研究对象, 采用针对FAK mRNA的特异性siRNA重组表达质粒进行转染。RTPCR显示, 所设计的两个siFAK重组质粒均能使其mRNA水平下降, 其中以siFAK1干扰效果更强, 在转染后48 h敲低效果最明显, 说明siRNA对FAK的抑制作用可能有时相性。而错义组则没有上述作用, 从而另一方面证明RNA干扰的特异性。同时免疫细胞化学检测结果也显示转染后48 h siFAK1对细胞FAK蛋白抑制更明显。
细胞增殖和迁移在多种恶性肿瘤的病理生理过程中起重要作用。有研究表明[8], 活化的FAKRASMAPK是促进细胞迁移和增殖的重要信号通路。本研究中, 细胞增殖及迁移实验表明, 靶向FAK基因干扰Caco2细胞后, 细胞贴壁能力降低, 变圆易脱落, 细胞的增殖及迁移明显受抑, 因此我们推测FAK基因表达受抑可使FAKRASMAPK信号通路受阻, 最终导致细胞增殖及迁移能力降低, 提示FAK基因可能是结直肠癌肿瘤治疗的一个新靶点。相反siRNASCR组对细胞的增殖及迁移无明显影响, 因此可以断定质粒载体pU6H1GFP可以作为安全有效的基因载体。近年来有关研究表明FAK与肿瘤细胞的凋亡相关。Huang等[9]发现FAK通过活化PI3K/Akt及MAPK/ERK1/2信号存活通路而引发NFκB活化, 最终阻断caspase3级联反应, 使细胞凋亡受抑。因此FAK的表达与凋亡密切相关。本实验初步研究结果显示, 通过Hoechst荧光染色发现siFAK转染Caco2细胞48 h后细胞呈现凋亡的形态学变化: 核致密浓缩, 染色体断裂, 并出现凋亡小体等特征。从分子机制来说, FAKsiRNA可能通过下调FAK mRNA和蛋白表达水平而促使Caco2细胞凋亡。
实验中2个siFAK重组质粒对靶基因的抑制效应不同, 其中以siFAK1抑制FAK基因mRNA、 增殖及迁移的作用最为明显, 这种针对同一基因的不同靶点而产生的不同干扰效果, 可能与位置效应有关[10]。因此说明利用RNA干扰进行肿瘤临床治疗要对干扰序列进行筛选。
综上所述, FAK与肿瘤的发生、 发展密切相关, 我们的初步研究结果表明, 干扰FAK基因表达后使Caco2细胞增殖、 迁移力明显减缓、 细胞出现凋亡等现象, 且FAK基因表达受抑后胞质形态结构受损, 其机制可能与抑制Caco2细胞FAK mRNA和蛋白表达水平有关。因此靶向抑制FAK基因的表达, 可能是结直肠癌治疗的有效途径。此研究为RNAi在肿瘤治疗方面奠定了实验基础, 也为临床研究和进一步的治疗研发提供了更多的依据。
参考文献
[1] Schmidmaier R, Baumann P. ANTIADHESION evolves to a promising therapeutic concept in oncology[J]. Curr Med Chem, 2008, 15(10): 978-990.
[2] 潘 宁, 章蔼然, 侯颖春. 黏着斑激酶活化与肿瘤进程研究进展[J]. 现代肿瘤医学, 2008, 16(12): 2222-2227.
[3] 黄培新, 刘 恒, 钟敏章, 等. 黏着斑激酶在结肠癌细胞中的表达及对其迁移的影响[J]. 中国中西医结合消化杂志, 2006, 14(4): 257-260.
[4] Lark AL, Livasy CA, Calvo B, et al. Overexpression of focal adhesion kinase in primary colorectal carcinomas and colorectal liver metastases: immunohistochemistry and realtime PCR analyses[J]. Clin Cancer Res, 2003, 9(1): 215-222.
[5] Cance WG, Harris JE, Iacocca MV, et al. Immunohistochemical analyses of focal adhesion kinase expression in benign and malignant human breast and colon tissues: correlation with preinvasive and invasive phenotypes[J]. Clin Cancer Res, 2000, 6(6): 2417-2423.
[6] Walsh MF, Thamilselvan V, Grotelueschen R, et al. Absence of adhesion triggers differential FAK and SAPKp38 signals in SW620 human colon cancer cells that may inhibit adhesiveness and lead to cell death[J]. Cell Physiol Biochem, 2003, 13(3): 135-146.
[7] Jiang F, Caraway NP, Li R, et al. RNA silencing of Sphase kinaseinteracting protein 2 inhibits proliferation and centrosome amplification in lung cancer cells[J]. Oncogene, 2005, 24(21): 3409-3418.
[8] Margadant C, Van Opstal A, Boonstra J. Focal adhesion kinase signaling and actin stress fibers are dispensable for progression through the ongoing cell cycle[J]. J Cell Sci, 2007, 120(Pt1): 66-76.
最近,有关肿瘤发生发展分子机制的研究表明,在恶性肿瘤细胞中,细胞内的各种基本过程是调节失控。这些过程包括:细胞周期的调控,信号传递通路的阻断,细胞凋亡等。研究者将注意力转向癌的病因学与病理过程中起作用的特异的分子及生物靶点。如细胞凋亡诱导剂、信号传导阻滞剂、血管生成抑制剂、化疗与放疗保护剂的寻找。
1 细胞凋亡诱导剂
细胞凋亡是在基因调控下发生的细胞自杀行为。细胞在各种因素如DNA损伤药物、生长因子撤出等作用下,Bcl-2、p53、C-myc、p21等细胞凋亡调控基因的表达发生改变,同时引起一系列生化变化,如胞内Ca2+水平升高,pH值下降,某些蛋白酶活性增高,最终发生细胞凋亡,已有越来越多的证据表明细胞凋亡与肿瘤的发生、发展、治疗及预后密切相关。
Bcl-2的过度表达使肿瘤细胞对一系列细胞毒化疗药物耐受性增加,p53缺失的小鼠对DNA损伤性药物同样表现高度抗性。因此,可以制定一种联合化疗的策略,一种药物抑制细胞凋亡抑制蛋白(Bcl-2,Bcr-Abl),降低Bcr-abl的表达,使Bcl-2失活,干扰其与Bax的结合,恢复p53功能;另一种细胞毒药物,以远低于通常所用的剂量直接杀伤肿瘤细胞,已得到实验证明是可行的。细胞内Ca2+升高在多种药物诱导的细胞凋亡中有重要作用,因此人为地调节细胞内Ca2+浓度,提高肿瘤细胞对凋亡诱导剂的敏感性,也是一种有效的治疗方法。这一疗法将为治疗非雄激素依赖的前列腺癌展示了美好前景。
2 信号传导阻滞剂
目前,研究肿瘤细胞信号传导机制,选择性阻断肿瘤细胞自分泌或旁分泌的信号传导通路,破坏其自控性生长调节机制,正在成为极具吸引力的研究热点。一方面可以通过阻断生长促进因子或增强生长抑制因子的作用,使肿瘤细胞的生长减慢或停止,另一方面也可以通过促进肿瘤细胞的分化,恢复其正常的生长调节机制而改变其恶性表型。这两方面的作用均可通过选择性地调变肿瘤细胞信号传导系统的不同组分而达到。这与经典的细胞毒性抗癌药物相比,具有选择性强、毒副作用小、不受细胞产生抗药性的影响等优点,尤其对晚期肿瘤或转移癌可能具有独到的疗效,很有希望成为新一代抗癌药物。因此研究肿瘤细胞信号传导机制具有潜在的应用价值和意义。细胞信号传导药物的作用方式可根据不同情况选择:
2.1 多数情况下,正常的细胞信号传导机制在肿瘤细胞中过度活跃,或正常信号分子过度表达。此时可通过部分阻断过度激活的细胞信号传导途径,或抑制过度表达的信号分子的方法,使肿瘤细胞生长速度减慢,直至接近正常细胞水平。
2.2 在某些情况下,肿瘤细胞中的信号分子选择性激活,使得细胞信号传导发生异常。可以利用这个特点,选择性地调变肿瘤细胞中的PKC亚型。许多肿瘤中可见不同的酪氨酸激酶受体的过度表达或过度激活,如上皮细胞肿瘤中常见EGFR家族受体的过度表达,血液细胞肿瘤中常见IGFR家族受体的过度表达,胶质瘤中常见PDGFR家族受体的过度表达等。因此,阻断酪氨酸激酶受体信号转导将抑制肿瘤的生长。
细胞信号传导抑制剂几乎是与基因治疗同步进入肿瘤临床治疗实验的。肿瘤细胞信号传导药物将是抗癌药物研究的一个重要方向。
3 血管生成抑制剂
从癌前病变到侵袭,癌发展阶段伴随着血管生成。目前已经阐明新生血管形成的机制,无疑为抗肿瘤药的发现提供了新的靶点,现已明确至少有12种血管生成促进剂和抑制剂,包括:血管内皮生长因子、FGF、血管生成剂等。这些因子在许多人、鼠肿瘤及正常组织中均有表达;同时,在肿瘤及正常组织中抗血管生成因子也有表达,这表明血管生成的调控有赖于正、负信号的相对平衡,这种平衡的失调便导致新的血管生成。
许多血管生成抑制剂已进入临床试验,包括TNP-470, Marimastat,干扰素(INF)α2a等。其中INFα-2a为第一个应用于临床,用以治疗晚期儿童血管瘤,第二代更为有效的内源性血管生成抑制剂,如Endostatin和可溶性VEGF受体均已进入临床试验。这些效果很好的血管生成抑制剂均需长期服药才能在动物模型上抑制血管生成以引起肿瘤减退,临床疗效有待证实。但无论如何,血管生成抑制剂是抗癌药物研究领域一个颇有前景的发展方向。
4 化疗与放疗保护剂
最新的研究进展表明,p53基因与肿瘤化疗和放疗所引起的副作用有着密切的关系。自1989年以来,人们在越来越多的不同类型的肿瘤中发现了p53基因的突变,其频率可达50-60%,突变的形式可表现为点突变、缺失突变、插入突变、移码突变、基因重排等。存在p53突变的肿瘤包括胃癌、结直肠癌、膀胱癌、乳腺癌、头颈部鳞状细胞癌、肺癌、前列腺癌、肝癌、胶质细胞瘤、软组织肉瘤等大多数实体瘤。目前临床上常用的抗肿瘤药如紫杉醇、阿糖胞苷等以及放疗所采用的UV射线、g射线等均被认为是通过诱导p53基因依赖性的细胞凋亡而发挥抗肿瘤作用。新近研究表明,在小鼠的一些正常组织如淋巴组织、造血器官、肠上皮、等均有p53高表达,而这些组织也正是许多抗肿瘤药物易损伤的部位,也即多数抗肿瘤药产生副作用的敏感器官,如白细胞减少、血小板减少、造血功能降低、胃肠道反应等等。
5 药物基因组学
【关键词】 治疗性克隆;细胞核;移植;胚胎干细胞
1治疗性克隆概述
治疗性克隆(therapeutic cloning)是体细胞核移植技术和最新的人胚胎干细胞技术结合的产物,将成为人类医疗历史上革命性的技术. 该技术首先应用患者体细胞,如皮肤细胞、骨髓间充质干细胞,作为核供体,移植入去核的人卵母细胞,获得克隆胚胎;然后从克隆胚胎分离建立胚胎干细胞系;并将这些胚胎干细胞在一定条件下,诱导分化成所需要的各种类型的细胞用于治疗目的[1,2]. 目前已报道,将产生多巴胺的神经元细胞用于治疗帕金森症[3],将产生胰岛素的胰岛细胞治疗糖尿病患者[4]. 从理论上来说由于使用的是患者自身的细胞生产出来的治疗用细胞,移植这些细胞到患者体内将不会产生免疫排斥反应. 另一方面,每年都有数以百万计的患者需要细胞、组织的修复或者器官移植,由于胚胎干细胞可以无限传代,在数量上可以保证治疗的需要,从而解决可供移植的细胞、组织和器官来源严重不足的瓶颈问题[5],为人类健康和长寿提供了新的希望.
近年来,利用核移植技术和胚胎干细胞技术相继建立了人核移植胚胎干(nuclear transfer embryonic stem cell,ntES)细胞系和人兔异种间ntES细胞. 这2项阶段性研究成果的取得,标志着治疗性克隆研究的巨大进步. 韩国科学家Hwang等[6]通过核移植技术获得了人人ntES细胞. 他们以健康女性志愿者的体细胞为核供体,以其自身卵母细胞为受体. 在30枚核移植囊胚中,得到20个内细胞团(ICMs),建成1株人 ntES细胞系,可传代培养70 代以上. 上海第二医科大学盛惠珍研究小组[7]在国际上首次构建了人兔核移植重构胚. 分别将5,42,52和60岁4个年龄组的人皮肤成纤维细胞核移入去核兔卵母细胞内,获得ntES细胞,通过原位杂交、免疫组化、核型和同源基因分析等证实 ntES细胞具有人源性,并且保持干细胞的未分化特性,能形成类胚体,在一定诱导条件下可以分化为神经、肌肉等3个胚层的细胞群. 200506,汉城国立大学的研究者[8]以患者的皮肤细胞为供体,以志愿者捐赠的卵母细胞为受体,利用体细胞核移植技术成功建立11株人核移植胚胎干细胞,这些细胞具有多能性,染色体正常,与供核患者的DNA一致、组织相容性抗原一致.
2治疗性克隆的应用前景
ES细胞在生物医学的各个领域均有广阔的应用前景,ntES细胞也有着同样广阔的前景,为临床治疗学、细胞生物学、生物发育学、比较动物学等研究提供研究材料和方法.
2.1临床疾病的治疗ntES细胞与普通的细胞移植治疗相比,具有革命性的进步. 它以患者的体细胞为核供体,通过核移植技术获得的ntES细胞,与患者的遗传物质相同,可以消除受体对供体的免疫排斥反应,为目前多种退形性疾病,如心脏病、脊髓损伤、帕金森病、1型糖尿病等的治疗带来了新的希望. 特别是一些目前还没有找出致病基因的遗传病,如脊髓侧索硬化症,ntES细胞移植是最有希望的治疗方法. 目前已经应用ntES细胞在体内外分化成多种细胞,包括神经细胞和生殖细胞[9,10]. 尤其Barberi等[9]建立了一套方法,能使 ntES细胞向中枢神经系统细胞特定分化,能产生高效率的神经胶质细胞、寡突细胞、神经元细胞,包括多巴胺能神经元、γ氨基丁酸能神经元等,将分化的多巴胺能神经元移植到 Parkinson病模型后,能改善其症状. 细胞治疗的途径有两种:其一,ntES细胞定向分化后移植. 细胞扩增后,体外定向分化,对分化细胞进行纯化,将获得的目的细胞移植到病变部位,替代丧失功能的部分细胞;其二,ntES细胞原位移植. 与定向分化后相比,ntES细胞原位移植有以下缺点:①没有经过纯化,可能将污染的异源饲养层细胞带进移植部位;②ntES细胞没有转入经选择基因,无法控制植入细胞的命运,可能发生癌变;③ntES细胞分化成分复杂,目的细胞分化成分少,可能出现大量非必须细胞的分化.
2.2细胞生物学通过研究ntES细胞的体外分化特性,可以识别某些靶基因,对人类新基因的发现,功能基因的研究,以及基因治疗的研究均有重要意义. 通过探讨ntES细胞体外增殖和分化的机制,了解各种生长和分化因子的作用,为组织再生和修复的研究提供了新的工具;通过诱导ntES细胞癌变,可分析肿瘤细胞发生的分子机制. ntES细胞作为一种得天独厚的研究材料,对于阐明细胞增殖、分化、凋亡、迁徙、恶变等机制有着重要意义. 自发现ES细胞以来,人们已经利用ES细胞建立了多种细胞类型的体外分化系统,体外分化的多种细胞类型都曾被成功的植入胎鼠或成体鼠,在受体鼠体内形成有功能的细胞群.
2.3发育生物学由于哺乳动物在母体内受胚胎发育的个体大小和内环境条件的限制,很难系统地研究其早期的发育进展、细胞分化及调控机制等. 比较动物卵母细胞质对同种或异种细胞核发育的影响,在细胞和分子水平上为研究哺乳动物胚胎早期发育的调控机制提供了良好的材料和方法,也为研究胚胎发育的影响因素提供了便利条件. 建立在ES细胞和基因打靶技术基础上的复杂的转基因系,使人们可以建立有效的分析系统,从而在分子水平上研究不同的生物学问题. 它不仅可以将一些在发育过程中对动物体非必需或可被替代的特定基因进行敲除(gene knockout),在体内进行功能缺失研究,而且还可以研究基因在不同发育时期中的作用. ntES细胞作为一种体外细胞系,提供了一个研究处理整体细胞群的实验体系. 因此,就有可能人为地产生一些基因突变,如对胚胎致死性基因的研究等,也可利用这些突变的基因来克隆产生转基因小鼠,从而建立基因突变的模型.
3治疗性克隆面临的问题
3.1亟待解决的问题①体细胞克隆效率与ntES细胞建系效率普遍较低:核移植胚发育至囊胚的几率为19%~25%,与牛、猪的核移植囊胚发育率相当分别约为25%和26%;从克隆囊胚获得ntES细胞的效率仅有4%~16%,平均8.2%[11]. ②卵母细胞来源问题:ntES细胞用于人治疗性克隆,卵母细胞的需求量是非常大的,目前尽管已有许多措施来改进核移植技术,但仍没有明显提高. 要得到一个ntES细胞系平均需要12 个囊胚,而所需要的卵母细胞数就更多了,一个ntES细胞系平均需要666个. 如果ntES细胞系用于人类疾病的治疗,这样的代价是非常大的,即使目前报道的最高效率的建系,也是30个卵母细胞,才能得到一个ntES细胞系. 另外一种替代策略就是利用非灵长类异种哺乳动物的卵母细胞,例如兔、山羊等. ③伦理问题:胚胎生物技术涉及使用早期未着床的胚胎,特别是治疗性克隆技术还将无法避免的使用通过体细胞克隆获得的人的早期克隆胚胎. 世界各国尤其是西方国家对此争论很大[12,13]. 迫于社会公众与宗教的压力,大多数西方国家对治疗性克隆技术应用于人类,持反对态度,不允许国家科研经费支持治疗性克隆的研究. ④临床应用问题:如ES细胞系可能在培养过程中出现染色体非整倍性问题,ES细胞定向分化能力及分化细胞的稳定性问题;其次,异种核移植产生的人动物重构胚还存在安全性问题:异种重构胚在发育早期含有2种线粒体,以后供核体的线粒体取代了受体的线粒体,但受体卵浆中所带的异种蛋白,包括细胞器及mRNA,它们的命运如何,是否也像线粒体一样完全被供核体所取代,还有待进一步证明. 再次,在核移植的过程中,可能存在跨种间病毒传染,例如,人兔核移植胚胎干细胞,有可能将某些目前未知的兔疾病传染给人类,就像艾滋病病毒可能是从非洲猩猩而来那样.
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3.2建立我国知识产权的治疗性克隆技术随着干细胞技术和体细胞核移植技术的研究进展,我国学者在治疗性克隆的技术方面也处于世界前列. 当前,在我国研究和发展治疗性克隆技术,建立我国知识产权的治疗性克隆的细胞产品,创建细胞治疗产业,是一个很好的机遇. 我国在治疗性克隆研究领域的优势:①目前,我国在哺乳动物克隆技术的研究方面处于国际先进水平,相继成功克隆出了牛、羊等动物. 1991年,西北农林科技大学生物工程研究所在世界上首次获得山羊胚胎细胞核移植成功,共得到5只羔羊. 1998年,该研究小组用来自成年雌性山羊的皮肤成纤维细胞作供体,采用细胞质内直接注射的方法将供体细胞核直接注入去核卵母细胞内,胚胎激活后移植到受体母羊子宫角,获得了2只体细胞核移植后代,这是世界上首批成年体细胞克隆山羊,并获得了克隆山羊的第4代后裔,目前仍生长健康. ②宽松的人文环境. 中国公众有着不同于西方的伦理观念,对于动物权利和早期胚胎的担心没有西方国家严重,也基本没有因为宗教信仰而反对胚胎生物技术的问题. ③法律和法规的基本保证. 为保证和促进人胚胎干细胞研究的健康发展,国家科技部和卫生部联合下发了《人胚胎干细胞研究的伦理指导原则》,使治疗性克隆的研究合法化. 但我国明令禁止克隆人和买卖人类胚胎.
然而,中国的优势不能在治疗性克隆的研究领域走在国际前列,主要原因是经费不足和相关学者缺乏协同研究. 应用克隆技术结合胚胎干细胞体外诱导分化和细胞治疗方法的关键是技术问题. 我们希望临床学者与基础细胞生物学家联手合作,借鉴国外的思路,应用自愿者的卵母细胞,建立中国人的ntES培养技术,为治疗性克隆的临床应用奠定基础. 我们坚信,中国有可能在这个领域走在世界前沿.
【参考文献】
[1] 贾战生. 肝病细胞治疗[M]. 北京: 人民卫生出版社, 2005:392-412.
[2] Hwang WS, Lee BC, Lee CK, et al. Human embryonic stem cells and therapeutic cloning[J]. J Vet Sci,2005;6(2):87-96.
[3] Bjorklund A, Dunnett SB, Brundin P, et al. Neural transplantation for the treatment of Parkinsons disease[J]. Lancet Neurol,2003;2(7):437-445.
[4] Segev H, Fishman B, Ziskind A,et al. Differentiation of human embryonic stem cells into insulinproducing clusters[J]. Stem Cells,2004;22(3):265-274.
[5] Atala A. Tissue engineering, stem cells and cloning: Current concepts and changing trends[J]. Expert Opin Biol Ther,2005;5(7):879-892.
[6] Hwang WS,Ryu YJ,Park JH,et al. Evidence of a pluripotent human embryonic stem cell line derived from a cloned blastocyst[J]. Science,2004;303(5664):1669-1674.
[7] Chen Y,He ZX,Liu A,et al. Embryonic stem cells generated by nuclear transfer of human somatic nuclei into rabbit oocytes[J]. Cell Res,2003;13(4):251-263.
[8] Hwang WS, Roh SI, Lee BC, et al. Patientspecific embryonic stem cells derived from human SCNT blastocysts[J]. Science,2005;308(5729):1777-1783.
[9] Barberi T,Klivenyi P,Calingasan NY,et al. Neural subtype specification of fertilization and nuclear transfer embryonic stem cells and application in Parkinsonian mice[J]. Nat Biotechnol,2003;21(10):1200-1207.
[10] Wakayama T. Cloned mice and embryonic stem cell lines generated from adult somatic cells by nuclear transfer[J]. Oncol Res,2003;13(610):309-314.
[11] Mombaerts P. Therapeutic cloning in the mouse[J]. Proc Natl Acad Sci USA,2003;100(Suppl 1):11924-11925.
【摘要】 为了观察了解儿童急性白血病细胞中转录因子PAX5的表达特性,采用实时定量RT-PCR方法测定了6个血液肿瘤细胞株以及6例正常儿童、58例初发和4例复发急性白血病儿童(其中包括39例B-ALL,10例T-ALL和13例AML)骨髓细胞中PAX5和CD19 mRNA的表达水平。结果表明:在Namalwa(B细胞系)细胞株中,PAX5和CD19 mRNA相对表达量分别为2.35%和2.52%;而在T-和髓系细胞株中几乎不表达。在临床样本中B-ALL组比T-ALL组和AML组的PAX5 mRNA表达高(P=0.029和P=0.013)。T-ALL组和AML组的PAX5 mRNA表达水平均低于正常对照组,而T-ALL组与AML组之间的表达差异无显著意义。在B-ALL患儿中,PAX5 mRNA表达的个体差异很大。此外还发现,初发治疗前组和复发组的B-ALL患儿PAX5 mRNA表达高于化疗完全缓解组(P=0.011和P=0.006)。由于在CD19基因的启动子上有B细胞特异性激活蛋白的结合位点,研究发现在B-ALL中PAX5表达水平与同样用实时定量RT-PCR检测的CD19表达水平之间存在明显的相关性。结论:运用实时定量RT-PCR方法能快速准确地在B-ALL的临床标本中检测和定量PAX5基因的表达。研究中发现部分B-ALL中PAX5 mRNA表达明显升高,因此它可将其作为进一步研究B-ALL发病机理的另一个切入点。
【关键词】 转录因子
Expression of the Transcription Factor PAX5 in Childhood Acute Leukemic Cells
Abstract
To investigate transcription factor PAX5 expression characteristics in childhood acute leukemic cells,expression levels of PAX5 and CD19 mRNA in 6 hematological tumor cell lines and bone marrow cells of 6 normal children,58 de novo patients and 4 relapse acute leukemic children,including 39 cases of B-ALL,10 cases of T-ALL and 13 cases of AML,were detected by a real-time RT-PCR. The results showed that PAX5 and CD19 mRNA expression levels were 2.35% and 2.52% in Namalwa (B-cell lines) respectively,but almost not detectable in other T- and myeloid cell lines. Among clinical samples,expression of PAX5 mRNA in B-ALL was significantly higher than that in T-ALL and AML(P=0.029 and P=0.013 respectively). PAX5 expression was significantly lower in T-ALL and AML than that in normal controls.The difference of PAX5 mRNA expression levels between T-ALL and AML was not significant. Inpidual difference of PAX5 mRNA expression levels in children with B-ALL was great. Moreover,PAX5 mRNA expressions in de novo
and relapse patients with B-ALL were significantly higher than those in remission (P=0011 and P=0.006 respectively). As binding sites for B-cell specific activator protein have been identified in the promoter regions of CD19,the study found that in B-ALL,there was clear correlation between the expression levels of PAX5 and CD19,which was also studied by real-time RT-PCR. It is concluded that PAX5 transcripts are readily detectable and quantifiable in clinical materials with B-ALL by real-time RT-PCR. The strong PAX5 mRNA expression in some B-ALL can be considered to be particularly interesting for further analysis.
Key words transcription factor;PAX5;CD19;acute leukemic cell;real-time RT-PCR
PAX5基因是成对区PAX基因家族的成员,它编码的核反式作用因子——B细胞特异性激活蛋白(B-cell specific activator protein,BSAP)在发育的中枢神经系统、成人和B淋巴细胞中表达[1]。在B细胞发育过程中,PAX5基因的转录起始于Pro-B(Pre-B1)期,表达于Pre-B和成熟B细胞中,但在浆细胞中不表达[1,2]。BSAP通过与多种B细胞特异性基因(如CD19,VpreB,RAG2,mb-1)启动子或增强子上的BSAP结合位点结合,对这些基因的表达起着调控作用,因而BSAP在B细胞定向分化、发育、增殖、同型转换、免疫球蛋白分泌和终末分化阶段中发挥了重要的作用[1]。近年来研究表明,PAX5基因在成神经管细胞瘤、成人恶性胶质瘤、淋巴瘤和人膀胱移行细胞癌中表达失调,并且与恶性分化程度相关[3]。在血液肿瘤中,以往有关PAX5的研究主要局限于在淋巴瘤中的改变[4-6]。有关PAX5在急性白血病(尤其是急性B淋巴细胞性白血病)中较为详尽的研究迄今为止文献报道很少[5,6]。本研究在mRNA水平运用实时定量RT-PCR检测血液肿瘤细胞株、儿童急性白血病细胞及正常儿童骨髓细胞中PAX5 mRNA的表达水平,从中了解PAX5在儿童急性白血病中的表达特性,为进一步明确其在急性白血病发生中的作用机制奠定基础,同时也为利用PAX5基因表达产物作为潜在肿瘤标志和基因治疗靶位的应用方面提供依据。
材料和方法
血液肿瘤细胞株及培养
6个血液肿瘤细胞株:Namalwa、SUP-M2、K-562、NB4、HL-60、Jurkat用含2 mmol/L谷氨酰胺和10%胎牛血清的RPMI 1640培养液在37℃、5% CO2及饱和湿度的培养箱中培养。
临床病例来源
2003年2月至2004年2月新华医院、上海儿童医学中心收治的初发和复发儿童急性白血病患者62例,其中初发病例58例,复发病例4例;男45例,女17例;年龄4个月-15岁,中位年龄6岁。所有患儿均采用MIC(即细胞形态学、免疫表型、细胞遗传学及相关的分子生物学)分型诊断。按FAB分型,ALL 49例(包括L1 15例,L2 21例,L3 7例,未分亚型者6例);AML 13例(包括M1 1例,M2a 3例,M2b 1例,M3 2例,M4 2例,M5 3例,M7 1例)。在ALL中,按免疫表型可分为T系-ALL 10例和B系-ALL 39例;39例B系-ALL(CD19+)还可进一步分成4个亚型,分别是: Pro B(CD10-/cytoplasmic μ〖cμ]-)1例,CALL(即Common-B-ALL,CD10+/cμ-)26例,Pre B(CD10+ or -/cμ+)11例和B Cell(即mature-B-Cell,SIg+)1例。另收集13例B系-ALL患儿诱导缓解治疗结束时微小残留病(MRD)监测
采集上述正常对照儿童及白血病患儿的骨髓或外周血标本2-3 ml(肝素抗凝),用淋巴细胞分离液室温300×g离心30分钟,分离单个核细胞,再用PBS洗涤2次,取约5×106个细胞加TRIZOL试剂1 ml,混匀后,-80℃保存,待提取RNA之用。初发和复发病例标本中白血病细胞的百分比>80%,必要时B系-ALL标本可通过CD19单克隆抗体免疫磁珠分选法富集白血病细胞(参见Immunotech公司免疫磁珠分选说明书)。
RNA提取和cDNA合成
总RNA提取参照TRIZOL试剂说明书。用紫外分光光度计测RNA浓度(RNA 浓度=A260×40 μg/ml×1/光径×稀释倍数)及纯度(A260/A280比值在1.8-2.0),再用2%琼脂糖凝胶电泳确定RNA质量,而后RNA可储存于-80℃备用。cDNA的合成根据TaqMan反转录试剂盒说明,把0.2 μg总RNA反转录成为单链cDNA。反应体系10 μl,包括10×TaqMan RT缓冲液1 μl,25 mmol/L MgCl2 2.2 μl,dNTPs mixture(2.5 mmol/L each dNTP)2.0 μl,50 μmol/L随机引物0.5 μl,RNase抑制剂(20 U/μl)0.2 μl,MultiScribe逆转录酶(50 U/μl) 0.25 μl,以及已溶解在3.85 μl无RNase水中的0.2 μg RNA。上述混合物孵育在25℃ 10分钟,48℃ 30分钟和95℃ 5分钟。所获得的cDNA可储存于-20℃备用。
实时PCR
实时定量PCR运用TaqMan Universal PCR Master Mix试剂盒在ABI Prism 7000实时荧光定量PCR仪上检测。PAX5、CD19和GAPDH的引物和探针采用TaqMan Assays-on-Demand基因表达产品,其MGB探针以FAM染料作为荧光标记。实时PCR反应体积25 μl各含TaqMan Universal PCR Master Mix(2×)12.5 μl,20×Assay-on-Demand Gene Expression Assay Mix 1.25 μl以及25 ng cDNA模板。PCR反应条件为:预热50℃ 2 分钟(激活uracil-N-glycosylase),95℃ 10分钟(灭活UNG酶,同时激活AmpliTaq Gold DNA Polymerase),紧接着40个循环的95℃ 15秒(变性)和60℃ 1分钟(退火和延伸)。本研究同时把Namalwa细胞株RNA反转录成的cDNA进行系列稀释作为实时PCR扩增模板进行PCR扩增,以证明靶基因PAX5、CD19和内源控制物GAPDH的扩增效率基本相同。由于所有的PCR反应具有基本一致的扩增效率,因此就可以用比较Ct法的相对定量策略,即每个样本PAX5、CD19的相对mRNA表达水平能直接用样本各自的内源控制物GAPDH表达来标准化加入的初始RNA量。简单地说,每个样本中靶基因PAX5、CD19的相对mRNA表达水平可以用以下公式计算:相对mRNA表达=2-Ct×100%,式中Ct值=靶基因Ct值-GAPDH Ct值。
统计学处理
用SAS 6.12统计软件包和Sigma Plot 2001,Version 7.101软件处理数据并绘制统计图,PAX5 mRNA相对表达量用x±SD(%)表示,采用t检验和线性相关与回归进行分析。P≤0.05被认为有统计学意义(双侧检验)。
结 果
血液肿瘤细胞株的PAX5和CD19 mRNA表达
本研究运用实时RT-PCR比较Ct相对定量法,检测了6个血液肿瘤细胞株中PAX5和CD19的mRNA表达,发现人成熟B细胞性淋巴瘤细胞株Namalwa的PAX5和CD19 mRNA相对表达量分别为2.35%和2.52%;而T细胞株(SUP-M2和Jurkat)的PAX5 mRNA表达极微量,分别为0.0033%和0.0018%,且未检测到其相应的CD19 mRNA表达;髓系细胞株(K-562、NB4和HL-60)PAX5 mRNA表达均为阴性。
急性白血病儿童与正常对照儿童的PAX5 mRNA表达
本研究运用实时RT-PCR检测了临床初诊和复发的39例B-ALL、10例T-ALL和13例AML骨髓白血病细胞PAX5 mRNA的相对表达量,同时也检测了6例非血液系统疾病儿童骨髓和8例健康儿童外周血单个核细胞PAX5 mRNA的相对表达量作正常对照。图1显示了上述不同类型的急性白血病和正常对照中PAX5 mRNA相对表达量的分布,从中可见B-ALL的PAX5 mRNA相对表达量范围变化很大,从(0.12-61.13)%不等。表1列出了急性白血病儿童与正常对照儿童平均PAX5 mRNA表达量的比较。统计表明: B-ALL组的平均PAX5 mRNA表达量比T-ALL组和AML组高(P0.05)。T-ALL组与AML组之间的平均PAX5 mRNA表达量差异也无显著意义(P>0.05),但其分别与正常对照BM和PB组的平均表达量差异有非常显著意义(P
B-ALL儿童的PAX5 mRNA表达
初发和复发B-ALL患儿骨髓白血病细胞的PAX5 mRNA表达范围变化很大,从0.12%到61.13%,平均表达(9.65±13.21)%,不存在性别差异(男女患儿平均表达分别为(8.53±12.13)%、(13.41±16.58)%,P=0.337)。本研究仅检测了1例10岁患儿的平均PAX5 mRNA表达为(5.22±6.34)%,两组之间差异无显著意义(P=0.284)。按照FAB分型,L1、L2和L3 3组之间的PAX5 mRNA表达经两两比较差异均无显著性意义(P>0.05)。
比较不同化疗阶段B-ALL患儿PAX5 mRNA表达发现:初诊化疗前组患儿与复发组患儿的平均PAX5 mRNA表达差异无显著意义(P>0.05),而化疗缓解(MRD
本研究在运用实时RT-PCR检测临床病例和正常对照的样本中PAX5 mRNA相对表达量的同时,还检测了样本中CD19 mRNA相对表达量。通过统计分析39例B-ALL样本中PAX5 mRNA与CD19 mRNA相对表达量之间的关系发现:在mRNA水平上PAX5的表达与CD19的表达之间存在明显的相关关系(r=0.516,P=0.0008)(图2)。
讨 论
儿童急性白血病(以急性B淋巴细胞性白血病为主)是严重危害儿童生命的恶性肿瘤。随着医学科学的进步,当前以化疗为主要手段的综合治疗已使大多数急性白血病患儿经治疗后可获得缓解,但最终仍有部分患儿复发。对于白血病的确切发病机制目前尚不清楚,因此从细胞发育、增殖、分化等方面多角度深入研究儿童急性白血病发生发展中的表达特性,从中逐步明确其发生机理,将为白血病的治疗提供新的思路并将提高白血病的治愈率及长期无病生存率。
在淋巴造血系统中,PAX5/BSAP被认为是B细胞特异性的标志。目前临床上对于PAX5/BSAP的研究主要集中于运用免疫组织化学检测正常淋巴组织细胞和血液肿瘤(主要是淋巴瘤)组织细胞中BSAP的表达[4-6]。Krenacs等[4]和Torlakovic等[5]对较大数量的多种亚型淋巴组织标本中BSAP表达的研究显示,BSAP仅表达于正常和肿瘤的B细胞中,且在不同的B细胞亚类和B细胞非何杰金氏淋巴瘤亚型中PAX5表达的水平各不相同,而在T细胞和T细胞性淋巴瘤细胞中表达为阴性。然而新近同样的研究,Zhang等[6]的报告却显示PAX5在1个T细胞性淋巴瘤细胞中表达,并且在T-ALL和AML中也有50%表达PAX5。此外,Hamada等[7]报道,运用RT-PCR能快速地在不同种类B细胞性肿瘤的临床标本中检测到PAX5转录。
本研究首先运用了实时RT-PCR比较Ct法的定量策略来检测血液肿瘤细胞株中PAX5和CD19的mRNA相对表达量,在6个血液肿瘤细胞株中Namalwa(B细胞系)的PAX5和CD19 mRNA相对表达量分别为2.35%和2.52%,而T系和髓系细胞株几乎不表达,这与Hamada等[7]的研究结果相近。
本研究还运用实时RT-PCR来测定临床初诊和复发的儿童急性白血病骨髓细胞中PAX5 mRNA的表达,并以正常BM和PB的单个核细胞作对照。研究发现:在不同白血病和正常对照中平均PAX5 mRNA表达高低依次顺序为B-ALL组>Normal BM组>Normal PB组>T-ALL组>AML组。由此可见,在儿童急性白血病中,PAX5主要在B-ALL中表达,而T-ALL和AML中表达均极低;研究中发现部分B-ALL中PAX5 mRNA表达明显升高,因此可将其作为进一步研究B-ALL发病机理的另一个切入点。
此外,不同化疗阶段B-ALL的PAX5 mRNA表达的分析发现:初诊化疗前组和复发组的平均PAX5 mRNA表达比化疗缓解组的表达高。因此,对于ALL儿童最好应在初诊化疗前即测定PAX5 mRNA表达,其后作动态观察,这样可以评估治疗反应,利于及时调整化疗方案。
在许多B细胞特异性基因的启动子上目前已发现多种BSAP的结合位点[8],其中包括CD19基因启动子上的BSAP结合位点[9],通过此位点BSAP对CD19表达起调节作用。CD19是B细胞表面信号传导系统的一个主要成分,它的活化启动多种细胞内信号传导途径[10]。本研究在用实时RT-PCR研究B-ALL中PAX5 mRNA表达的同时,也检测了相应的CD19 mRNA表达,经统计分析两者之间的表达存在明显的相关性,与此前的有关研究报道[6,7]不甚一致,其可能的原因是: ①研究对象不同,此前的报道主要是淋巴瘤,且研究标本量少;本研究对象则为B-ALL,标本量相对较多;②研究方法不同,此前的报道运用的是Northern blot,传统PCR和流式细胞术;本研究运用实时RT-PCR。鉴于在B-ALL中PAX5与CD19 mRNA表达之间存在的明显相关性,可以认为,在B-ALL中PAX5通过调控其目标基因CD19表达来影响细胞内多种信号传导途径,进一步可能影响肿瘤的发展。
由于目前未见有关详细研究白血病中PAX5 mRNA表达特性的文献报道,因此没有与本研究结果可以相比较的相关资料可资参照分析。也就是说,本研究可能是首次较为详尽地报道运用实时RT-PCR评估急性白血病细胞中PAX5 mRNA的表达。至于在B-ALL中PAX5表达的更加确切的规律和作用,还有待于对更多临床样本进行较为长期的观察研究。
参考文献
1Adams B,Dorfler P,Aguzzi A,et al. Pax-5 encodes the transcription factor BSAP and is expressed in B lymphocytes,the developing CNS,and adult testis. Genes Dev,1992;6:1589-1607
2Barberis A,Widenhorn K,Vitelli L,et al. A novel B-cell lineage- specific transcription factor present at early but not late stages of differentiation. Genes Dev,1990;4:849-859
3Stuart ET,Yokota Y,Gruss P. PAX and HOX in neoplasia. Adv Genet,1995;33:255-274
4Krenacs L,Himmelmann AW,Quintanilla-Martinez L,et al. Transcription factor B cell specific activator protein (BSAP) is differentially expressed in B cells and in subsets of B-cell lymphomas. Blood,1998;92:1308-1316
5Torlakovic E,Torlakovic G,Nguyen PL,et al. The value of anti-pax-5 immunostaining in routinely fixed and paraffin-embedded sections: a novel pan pre-B and B-cell marker. Am J Surg Pathol,2002;26:1343-1350
6Zhang X,Lin Z,Kim I. Pax5 expression in non-Hodgkin’s lymphomas and acute leukemias. J Korean Med Sci,2003;18:804-808
7Hamada T,Yonetani N,Ueda C,et al.Expression of the PAX5/BSAP transcription factor in haematological tumour cells and further molecular characterization of the t(9;14)(p13;q32) translocation in B-cell non-Hodgkin’s lymphoma. Br J Haematol,1998;102:691-700
8Neurath MF,Stuber ER,Strober W. BSAP: a key regulator of B-cell development and differentiation. Immunol Today,1995;16:564-569
【关键词】 胃肿瘤;抑癌基因;Runx3
Runx3(PEBP2αC/CBF A3/AML2)基因是一个肿瘤抑制基因,其功能缺失与多种恶性肿瘤的发生发展有关。自2002年日本学者Li等[1]首先报道Runx3有调节胃上皮细胞的增生与凋亡平衡的作用以来,Runx3与胃癌发生、发展的相关研究已成为胃癌研究领域的热点。现对Runx3与胃癌的研究现状做一综述。
1 Runx3基因、蛋白结构及其功能
Runx3来自Runt结构域转录因子(Runt domain transcription factors),是转录因子Runx家族成员之一,Runt区域转录因子也称PEBP2/CBF(polyomavirus enhancer-core binding protein 2/core binding factor),是TGF-β超家族信号重要的靶目标,在哺乳动物生长过程中扮演重要角色。该基因家族在哺乳动物有3个成员Runx1、Runx2、Runx3,它们的产物都是由α和β亚单位构成的异二聚体[2],具有不同生物学功能,Runx1与造血功能有关,Runx2是重要的骨生成调节因子,Runx3对脊神经节的神经发育及胃黏膜上皮细胞的增生调控和T细胞的分化起重要作用[1,3]。
Runx3(Runt related transcription factor 3 gene)基因位于人染色体的1p36.1,基因全长约67 kb,含有P1和P2 两个启动子,6个外显子和1 290 bp的开放阅读框,内含子1跨越了整条基因全长的一半(35kb)。两个启动子区域均含数个分离的转录起始点,其中Runx3 mRNA主要来自于P2启动子的转录[3]。两个启动子的GC含量不同,P2启动子GC含量高(64%)。在外显子2 相当于启动子P2 的位置和外显子6 的起始部位有两个大CpG岛[4]。
人类Runx3蛋白是α、β两个亚单位构成的异二聚体,包含415个氨基酸残基,α亚单位含有一个 RD(Runt domain)保守域,RD位于Runx蛋白的氨基酸末端,由128个氨基酸组成,介导Runx蛋白与DNA结合以及蛋白质之间的相互作用[5,6]。α亚单位介导RD与靶DNA结合,β亚单能增强RD与靶DNA的结合力[7]。
Runx蛋白的羧基端富含脯氨酸和丝氨酸,对基因的转录调控起重要作用[2,7]。
2 Runx3与胃癌的相关研究及其抑癌机制
2.1 Runx3与胃黏膜的关系 Li等[1]研究发现敲除Runx3(Runx3-/-)的小鼠胃黏膜明显增厚,Runx3-/-小鼠培养细胞对TGF-β诱导的生长抑制和凋亡作用不敏感,且Runx3-/-小鼠胃组织中半胱天冬酶3(caspase3)无活性[1]。Fukamachi等[8]研究发现Runx3 缺失时胃黏膜细胞处于低分化状态。这些观察表明Runx3是胃黏膜上皮主要生长调控因子,是胃上皮细胞中重要的致凋亡因素。
2.2 胃癌中Runx3表达情况 研究发现,胃癌中Runx3的表达明显下调或缺失。Li等[1]应用RT-PCR、Southern blot和原位杂交方法对15株胃癌细胞系和46例胃癌组织标本的Runx3 mRNA表达进行检测,结果发现47%的胃癌细胞系中Runx3无或低表达;60.9%的胃癌组织中Runx3无表达或低表达,Runx3的表达率与胃癌临床分期呈负相关。所以认为Runx3 基因与胃癌的发生、发展有着极其密切的关系,并且随着胃癌分期的增高表达进一步降低。Osaki等[9]应用Western印迹法分析了6株胃癌细胞系Runx3蛋白质的表达情况,结果50%的细胞系Runx3表达阳性,与Li等报道的结果基本一致;此外,还通过免疫组化法揭示83例正常胃黏膜组织均有Runx3表达,而对应的肠上皮化生组织和癌组织中均无Runx3 表达[9]。
2.3 Runx3与胃癌的相关性 Li等[1]报道Runx3-/-、p53-/-小鼠胃黏膜培养细胞能建立裸鼠种植肿瘤(腺癌),而Runx3+/+、p53-/-小鼠胃黏膜上皮培养细胞则不能,这表明Runx3功能缺失可能诱导了胃癌的发生。Guo等[10]以胃癌细胞系(Runx3-/-)作为感受态细胞,将外源性Runx3基因分别转染克隆体,结果显示,Runx3高表达克隆组细胞生长抑制最明显,Runx3低表达组次之,说明Runx3的表达量与胃癌细胞的生长曲线成负相关。Sakakura等[11]研究发现胃癌原发灶和腹膜转移灶Runx3 mRNA表达较正常胃黏膜明显下调,尤以腹膜转移灶下降程度最著。将转染外源性Runx3的胃癌细胞系注入裸鼠腹腔,结果转染组腹腔内极少有种植结节,而无转染对照组动物腹腔内有大量的、明显的种植结节形成。因此认为Runx3基因的失表达与胃癌的腹膜转移发生有关。Wei等[12]揭示胃癌组织中Runx3表达水平与患者的生存期密切相关。Peng 等[13]通过对120例胃癌组织中Runx3表达与血管内皮生长因子(VEGF)表达的相关分析,揭示Runx3的转录可能与胃癌组织中VEGF的表达下调有关。因此Runx3基因沉默可能会加速胃癌的生长和远处转移。
2.4 Runx3抑癌机制 Runt区域转录因子与TGF-β超家族成员共同介导一些重要的生物学效应。TGF-β与其跨膜受体Ⅰ和Ⅱ(TβRⅠ和TβRⅡ)结合,产生受体异四聚体复合物(TβRC),从而发挥细胞内生物效应[14],此过程中Smad蛋白起重要的作用。TGF-β信号转导通路的配体、受体和胞内信号转导分子Smad蛋白共同组成一个抑制肿瘤信号的通路。通路异常即可引起信号紊乱,促进多种肿瘤的发生和发展[15]。Runx3蛋白是TGF-β信号通路下游的一个转录因子,Runx蛋白与DNA结合,在TGF-β/BMP(bone morphogenetic protein)信号传导中起重要作用。只有在Runx蛋白的参与下,Smad复合物才能从细胞质内转入核内的功能靶点,与Runx蛋白共同转录激活靶基因,从而对细胞的分化、周期调控、凋亡和恶性转化起作用[16]。当Runx基因表达受抑制时,影响TGF-β信号通路的转导,从而诱导肿瘤的发生。
Chi等[17]研究显示Runx3是p21基因的下游调控子,p21在细胞生长周期中有重要作用,其通过抑制周期素依赖性蛋白激酶(cyclin-dependent Kinase,CDK)表达而使细胞周期停滞于G1期。p21启动子包括5个Runx结合位点,即3个完全匹配的a、b、c位点和2个部分匹配的d、e位点,当Runx结合域突变时,p21启动子的活性明显降低,而Runx3和Smad3协同表达时p21启动子被激活,从而使细胞对TGF-β反应增强。Runx3的抑癌活性与其诱导p21表达的能力相关,p53也是通过调控p21表达活性来调节细胞生长周期,故两者作用机制类似,但作用的信号通路不同。最近有研究显示恢复Runx3表达可导致cyclin D表达下调,相反 p27和caspase3、7和8则表达上调。这可能是Runx3诱导凋亡的潜在机制[14]。
因此,Runx3抑癌机制主要通过TGF-β信号通路协同Smad蛋白激活p21调节细胞生长周期,并通过下调cyclin D表达和上调p27和caspase3、7和8的表达而诱导凋亡。
3 胃癌中Runx3基因表达降低或缺失的机制
3.1 Runx3基因突变与表达 基因突变是抑癌基因沉默的主要机制之一,然而文献报道突变不是Runx3表达下调的主要机制[1,12,18]。
3.2 Runx3基因杂合性缺失与表达 Li等[1]应用荧光原位杂交技术(FISH)对15个胃癌细胞系和46例胃癌组织Runx3DNA倍体进行分析,结果发现20%的胃癌细胞系和30%的胃癌组织中的Runx3为异倍体。并采用RT-PCR方法和原位杂交方法分别对这些发生杂合缺失胃癌细胞系和胃癌组织标本进行Runx3 mRNA表达的检测,发现除1例胃癌组织可以检测到Runx3 mRNA表达外,其余均无Runx3 mRNA表达。22例Ⅰ期胃癌中有3例Runx3存在杂合缺失,2例Ⅱ期胃癌没有发现杂合缺失,14例Ⅲ期胃癌中3例Runx3 存在杂合缺失,8例Ⅳ期胃癌中Runx3全都发生杂合缺失变化,说明Runx3的杂合缺失是胃癌中Runx3失活的原因之一,并且Runx3的杂合缺失和胃癌的分期有关。
3.3 Runx3甲基化是胃癌中Runx3表达下调的主要原因 启动子异常甲基化在基因表达调控、DNA修复、基因稳定及基因抑制方面起重要作用。Runx3启动子P2区域有一个典型CpG岛,理论上说明DNA甲基化可调控P2的转录。
Li等[1]揭示Runx3低表达或失表达都与Runx3启动子P2区域CpG岛过甲基化有关。Guo等[10]用N2甲基2N2亚硝基脲诱导鼠胃癌,从中建立4株胃癌细胞系,结果仅一株细胞系有微量的Runx3 mRNA表达,其他3株细胞系均无Runx3 mRNA表达,这3株Runx3基因沉默细胞系在Runx3启动子区域亦存在明显甲基化,所有细胞系经过DNA甲基化转移酶抑制剂52氮唑22脱氧胞苷(deoxycytidine,AZA)、组蛋白去乙酰酶抑制剂曲古抑菌素(trichostatin,TSA)共同处理后均恢复了Runx3表达。Waki等[19]检测了10株胃癌细胞系、93例胃癌组织及相应正常胃黏膜组织Runx3 基因启动子甲基化状态,结果7株胃癌细胞系、42例胃癌组织和7例正常胃黏膜组织存在甲基化。此外,对19例尸检的正常胃黏膜组织Runx3甲基化状态进行检测,其中3例存在甲基化,但年龄均≥77岁,提示除高龄患者外Runx3甲基化几乎是癌特异性的。Kim等[20]对75例胃癌和各种胃癌前期病变组织(胃腺瘤77例、慢性胃炎伴肠上皮化生32例和慢性胃炎不伴肠上皮化生99例)Runx3甲基化状态进行检测,结果发现在胃癌组织中Runx3甲基化发生率为64%,而在各种胃癌前期病变组织中也存在不同程度的Runx3甲基化,其中胃腺瘤27.3%、慢性胃炎伴肠上皮化生28.1%和慢性胃炎不伴肠上皮化生8.1%。而在有腹膜转移的胃癌标本100%发现Runx3甲基化[11]。因此认为Runx3甲基化发生随癌前期病变向癌的方向发展而增加,从原位癌到进展期胃癌Runx3甲基化率随之升高,说明Runx3甲基化从胃癌的发生到胃癌的发展都有很重要的意义。Homma等[21]发现,大多数胃癌细胞系(90%)、胃癌组织(96%)和配对的正常胃黏膜组织(96%)均存在Runx3基因5′端CpG岛的甲基化,而在被视为导致基因沉默的关键部位——转录起始点附近区域的甲基化发生率较低,分别为40%、53%和11%。因此认为,Runx3 基因高甲基化起初发生在5′端CpG岛,进而向转录起始点区域扩展,最终导致Runx3 mRNA失表达,Runx3基因CpG岛多区域甲基化状态检测对胃癌的诊断及风险评估具有重要意义。
4 小结
Runx3作为一个新发现的抑癌基因,在调控细胞生长、发育、凋亡和以细胞的信号传导及其他生物学效应方面有着重要的转录调节作用。其启动子P2区域CpG岛的过甲基化和杂合缺失是Runx3基因沉默的主要机制。Runx3的转录失活或表达下调可致胃黏膜上皮细胞的过度增生和分化异常,进而参与胃癌的发生和发展过程。Runx3有望成为一个恶性肿瘤,特别是胃癌发生发展的生物学标记物和肿瘤基因治疗的靶点(如Runx3基因的导入、逆转甲基化治疗等),有可能为胃癌等恶性肿瘤的诊疗提供新的策略和方案。
参考文献
1 Li QL,Ito K,Sakakura C,et al.Causal relationship between the loss of RUNX3 expression and gastric cancer.Cell,2002,109(1):113-124.
2 Ito Y.Molecular basis of tissue-specific gene expression mediated by the runt domain transcription factor PEBP2/CBF.Genes Cells,1999,4(12):685-696.
3 Bae SC,Choi JK.Tumor suppressor activity of RUNX3.Oncogene,2004,23(24):4336-4340.
4 Bangsow C,Rubins N,Glusman G,et al.The RUNX3 gene-sequence,structure and regulated expression.Gene,2001,279(2):221-232.
5 Coffman JA.Runx transcription factors and the developmental balance between cell proliferation and differentiation.Cell Biol Int,2003,27(4):315-324.
6 Tang YY,Shi J,Zhang L,et al.Bushweller JH.Energetic and functional contribution of residues in the core binding factor beta(CBFbeta)subunit to heterodimerization with CBFalpha.J Biol Chem,2000,275(50):39579-39588.
7 Yang N,Zhang L,Zhang Y,et al.An important role for RUNX3 in human L1 transcription and retrotransposition.Nucleic Acids Res,2003,31(16):4929-4940.
8 Fukamachi H.Runx3 controls growth and differentiation of gastric epithelial cells in mammals.Dev Growth Differ,2006,48(1):1-13.
9 Osaki M,Moriyama M,Adachi K,et al.Expression of Runx3 protein in hunman gastric mucosa,intestinal metaplasia and carcinoma.Eur J Chin Invest,2004,34(9):605-612.
10 Guo WH,Weng LQ,Ito K,et al.Inhibition of growth of mouse gastric cancer cells by Runx3,a novel tumor suppressor.Oncogene,2002,21(54):8351-8355.
11 Sakakura C,Hasegawa K,Miyagawa K,et al.Possible involvement of Runx3 silencing in the peritoneal metastases of gastric cancers.Clin Cancer Res,2005,11(18):6479-6488.
12 Wei D,Gong W,Oh SC,et al.Loss of Runx3 expression significantly affects the clinical outcome of gastric cancer patients and its restoration causes drastic suppression of tumor growth and metastasis.Cancer Res,2005,65(11):4809-4816.
13 Peng Z,Wei D,Wang L,et al.RUNX3 inhibits the expression of vascularendothelial growth factor and reduces the angiogenesis,growth,and metastasis of human gastric cancer.Clin Cancer Res,2006,12(21):6386-6394.
14 Ito Y,Miyazono K.RUNX transcription factors as key targets of TGF2beta superfamily signaling.Curr Opin Genet Dev,2003,13(1):43-47.
15 Miyazono K,Suzuki H,Imamura T.Regulation of TGF-beta signaling and its roles in progression of tumors.Cancer Sci,2003,94(3):230-234.
16 Zaidi SK,Sullivan AJ,Van Wijnen AJ,et al.Integration of Runx and Smad regulatory signals at transcriptionally active subnuclear sites.Proc Natl Acad Sci USA,2002,99(12):8048-8053.
17 Chi XZ,Yang JO,Lee KY,et al.RUNX3 suppresses gastric epithelial cell growth by inducing p21(WAF1 /Cip1) expression in cooperation with transforming growth factor{beta}-activated SMAD.Mol Cell Biol,2005,25(18):8097-8107.
18 曾超,贺修胜,罗桥,等.RUNX3基因在胃癌中的表达及其表达下调机制.世界华人消化杂志,2006,14(3):250-255.
19 Waki T,Tamura G,Sato M,et al.Promoter methylation status of DAP-kinase and Runx3 genes in neoplastic and non-neoplastic gastric epithelia.Cancer Sci,2003,94(4):360-364.
关于椎间盘源性腰痛的概念
所谓“椎间盘源性腰痛”从广义来上讲,是指与腰椎间盘退变有关的腰痛症状,当包括椎间盘内紊乱,椎间盘退行性病以及腰椎不稳。1997年Bridwell确定椎间盘源性下腰痛的概念为[1]:椎间盘内各种疾病(如退变,终板损伤等)刺激椎间盘内疼痛感受器所引起的功能丧失的腰痛,不伴根性症状,无神经或节段过度活动的影像学证据。目前这个概念被大多数学者所接受。
椎间盘源性腰痛的发病机制
髓核和纤维环的破裂:椎间盘纤维环破裂是椎间盘源性下腰痛的重要原因,在无神经根机械性压迫的下腰痛患者中,约40%与椎间盘纤维环破裂有关。Osti等对27例脊柱尸检标本(平均年龄31.5岁)中的135个腰椎间盘进行分析研究[2],将纤维环损伤分为外周型、环型和辐射型,髓核则分为正常、中度退变和严重退变。对中老年患者,椎间盘纤维环破裂的最常见病理基础是髓核变性致纤维环应力分布失衡,进而导致后部纤维环破裂,而病变椎间盘内高含量的炎性介质刺激窦椎神经末端的伤害感受器可导致剧烈疼痛。但对于年轻的患者,特别是有剧烈运动史时,外周纤维环的物理损伤可能是导致疼痛的原因之一。
腰椎间盘的神经分布及发病机制:IDD发生与腰椎间盘神经分布相关密切。腰椎间盘在纤维环外1/3处存在丰富的神经分布,正常情况下纤维环内1/3和髓核无神经分布。纤维环前外侧由灰交通支支配,后外侧主要由窦椎神经分布。石作为等研究认为部分椎间盘源性腰痛也具有牵涉痛的性质[3],其理由为腰椎间盘后部纤维环及后纵韧带受脊神经和交感神经的双重支配,交感神经可传递疼痛,脊神经节多极神经元的存在且能够传递疼痛。
椎间盘内化学物质的刺激:炎症介质也与椎间盘源性疼痛的发病机制有关。研究发现退变的人椎间盘组织可自动分泌大量的促炎症反应介质,使局部出现自身免疫炎症反应。
椎间盘内机械压力的改变:正常椎间盘在生理负重下不会刺激外部纤维环上的伤害感受神经末梢。随着椎间盘的退化,髓核和软骨终板变性,纤维环的松弛或破裂可导致椎体间不稳,造成椎间盘内压力的分布不均衡,并导致椎间盘出现异常活动,这些异常活动对纤维环的后1/3和相邻的后纵韧带中带有大量来自窦椎神经的感觉神经末梢产生机械刺激而引起疼痛。
硬膜外炎症及化学性神经根炎:由纤维环破裂导致的硬膜外炎症也可能导致疼痛的产生,Saifuddin等研究伴随纤维环破裂的硬膜外炎症患者[4],在8例患者MRI的T2加权像发现12个破裂的纤维环,而炎性改变总伴随有纤维环的破裂。其中4例患者炎性区域直接包括神经根。这些结果表明,由纤维环破裂处的炎性化学性神经根病可能是纤维环撕裂引起疼痛的重要原因。
椎间盘源性腰痛的诊断研究
椎间盘源性腰痛临床表现常为L4/L5/S1棘间、髂后、臀部、腹股沟、股前、股后、大转子等处的自发胀痛。患者常常需要手扶大腿才能坐在椅子上或从椅子上站起。虽然椎间盘源性腰痛可以伴有腿痛,但是,腿痛通常没有明确的概念,常常难以言表,多主诉为臀部或下肢沉重感或抽筋,而且疼痛区域缺乏沿神经分布的特点,神经系统检查正常,没有皮肤过敏或感觉缺失。
在影像学诊断方面,普通X线摄片和CT表现基本正常。MRI对于椎间盘源性疼痛的诊断有重要的意义。椎间盘造影术是椎间盘源性疼痛最重要的诊断方法,在诊断椎间盘源性腰痛上,椎间盘造影必须包括4个要素:椎间盘形态,椎间盘内压力或可注射的液体量,注射时诱发出主观感觉的疼痛,相邻节段注射时没有主观疼痛反应,这四个要素缺一不可。椎间盘造影能够准确地复制出平时的疼痛甚至被认为是诊断椎间盘源性腰痛的金标准。
椎间盘源性腰痛治疗进展
非手术治疗:由于IDD最终确认诊断需经椎间盘造影有创检查,所以当初步印象为IDD时,一般先采用3个月左右的保守治疗,保守治疗包括卧床休息、腰背肌锻炼、口服止痛药、牵引、理疗、推拿按摩、针灸、针刀、封闭等。迄今为止尚无高质量的研究证明某项保守治疗方法与其他或手术治疗相比具有优越性。
手术治疗:当保守治疗无效时,椎间盘造影即为必要的检查。对于手术治疗时机及指征,Linson提出症状至少持续l2个月[5],椎间盘造影疼痛诱发试验阳性,在CTD显示异常形态学改变,此为介入治疗和手术治疗的指征。
微创治疗:经皮技术治疗IDD的方法主要有:经皮穿刺腰椎间盘摘除术、椎间盘内药物注射(如亚甲基蓝椎问盘内注射)、经皮穿刺髓核化学溶解术、经皮穿刺腰椎间盘内臭氧注射术、经皮穿刺腰椎间盘激光消融术(PLDD)、椎间盘内电热疗法(IDET)、椎间盘等离子消融术、射频消融和侧后路内镜辅助技术等。
开放手术治疗椎间盘源性腰痛的手术治疗方法:⑴椎间融合术:椎间融合术包括前路椎间融合术(ALIF)、后路椎间融合术(PLIF)、经椎间孔椎间融合术(TLIF)融合等。由于椎间融合器械的使用和推广,椎间Cage融合器和椎弓根钉杆系统逐渐取代了单纯植骨融合技术和单纯钉板系统,椎间融合率大幅度提高。目前,椎间融合术已成为治疗椎间盘源性下腰痛的金标准,但高融合率并不一定代表治疗的高成功率。临床长期随访结果显示,在融合良好的病例中仍有相当比例的患者症状并未改善,而且椎间融合术中晚期并发的邻近节段病也是脊柱外科医生必须面对的难题之一。⑵非融合一动态稳定手术:①棘突间固定:一般认为,纤维环后部是椎间盘源性腰痛主要的疼痛来源,棘突间固定可通过撑开脊柱后方结构来减少纤维环后部的压力负荷,恢复椎间隙的高度,可以减少对窦椎神经伤害性神经末稍的机械刺激而缓解疼痛,还可以促进纤维环等机构的恢复。②人工髓核置换术:目前在髓核假体中研究最多、使用最广泛的是PDN假体,该手术保留了纤维环、终板及韧带等结构,手术创伤小,但髓核假体要求椎间盘纤维环完整,否则容易造成假体脱出,在很大程度上限制了该手术的应用范围。③人工椎间盘置换术(TDR)人工椎间盘置换术的优点在于:彻底切除病变椎间盘,消除椎间盘源性疼痛;恢复椎间高度,神经根能充分活动;恢复生理前凸,获得生物力学平衡;恢复运动功能,防止相邻节段退变。
讨 论
椎间盘源性腰痛是慢性退行性疾病,对于其病因、发病机制、诊断及治疗已进行了大量的研究,但该疾病与基因的关系还不明确,还没有一种比椎间盘造影更加可靠和特异性的诊断方法。目前没有一种治疗方法对所有的椎间盘源性腰痛都有效,而大多数患者通过保守治疗都能够缓解,这些方法费用低,操作简单,无侵入性,因此保守治疗应该成为椎间盘源性腰痛治疗策略的第一阶梯[6]。微创治疗具有创伤小,安全可靠,治疗效果并不比手术等其他治疗方法差,对保守治疗无效的患者,可以考虑IDET、RFA、PLDD等微创手术治疗,尽可能推迟开放性手术的时间。随着非融合手术的研究不断深入,棘突间固定,人工髓核及人工椎间盘置换术,取得了较好的短期疗效,目前还缺乏长期随访和大样本的研究,但这可以推迟行椎体间融合手术的时间。近年来,人们发展了异体椎间盘移植和基因修饰治疗椎间盘退变等新方法,前者由于存在早期退变等一系列问题而难以再临床应用;基因治疗椎间盘退变尚处于早期的实验阶段,但可以肯定,基因和细胞水平治疗椎间盘源性下腰痛将是以后临床和基础研究的重点方向之一。
参考文献
1 Bridwell KH,Rewatd RI.The Textbook Spine Surgery.Lip pin.
2 Osti OL,Vernon-Robeas B,Moore R,et al.Annular tears and disc degeneration in the lumbar spine,a post-modem study of 135 discs[J].J Bone Joint Surgery,1992,74:678-682.
3 石作为,姚猛,王岩松,等.间盘源性下腰痛发生机制的探讨.中国疼痛医学杂志,2007,3:32-35.
4 Saifuddin A,Mitchell R,Taylor BA.Extra dural inflammation associated with annular tears:demonstration with gadoliniumenha need Iumbar spine MRI[J].Eur Spine J,1999,8:34-39.
1癌症心理护理
大量事实证明,癌症患者生命期不仅取决于病情和医疗措施,而且与患者自身的精神状态密切相关。调查结果表明:癌症患者确诊后产生否认、多疑、紧张、悲观、恐惧、绝望等负性情绪,对机体免疫功能有明显的抑制作用,严重影响生存率和生活质量。所以心理护理对癌症患者非常重要,也是整体护理的核心内容,心理护理质量的高低决定着护理质量的高低。和蔼的态度、精湛的技术、强烈的责任心是心理护理的基础。护士要尽可能和患者建立起良好的护患关系,为患者创造温馨舒适的生活环境,解开患者的心结,激发患者生存欲望,使他们走出心理阴霾,树立和医护人员紧密配合的心理认同感。由于患者的思维层次、沟通意愿和对肿瘤认识存在的差异,实现与他们的心灵沟通,护士要有高度的同情心,理解患者的心理活动规律,运用一定的技巧,根据患者情况采用相应的方法。有移情法、暗示法、开导法、集体心理治疗等。要因人而异,有的放矢。
2癌症饮食护理
由于癌症导致患者代谢紊乱、负氮平衡,免疫力低下,白细胞减少,脱发等,最终成为恶病质。因此对患者进行饮食护理,改善营养状况十分必要。护士要采取各种方法鼓励患者进食,经常更换食谱,变化烹调方式,注意色、香、味的调配,给予高热量、高蛋白,少油腻、易消化的清淡饮食,少食多餐。每天摄入新鲜蔬菜水果,以提高食欲,补充微量营养素,对进行放、化疗的患者,要常吃动物肝脏、猪血、瘦肉、黑芝麻,莲子、大枣、枸杞子、桂圆等,以维持正常的血细胞数量和功能;建议多进食含钾高的水果,如苷橘、香蕉等,同时忌烟酒、浓茶、咖啡及粗糙的食物;如果出现咽喉有灼热感,口干,吞咽困难等口腔粘膜反应,应给患者经常漱口,保持口腔湿润,食物制成肉汁、肉汤一起进食,有助于吞咽,从而提高患者的进食量。尽力创造干净、舒适、清洁的病房进食环境。
3癌症姑息护理
姑息护理是新兴的学科,是对根治性治疗无反应的患者积极的整体关怀护理,即通过早期识别、积极评估、控制疼痛和治疗其他痛苦症状,摆脱躯体、心理、社会和宗教的困扰,从而改变患者及亲人的生活质量。姑息护理强调四全服务,即全人、全家、全程、全队。通过团队的方法提供整体护理,把患者、家属作为照护单元。不主张实施可能给患者增添痛苦和无意义的治疗或过度治疗,强调减轻痛苦,让患者平静、安然、有尊严地离开人世,即优化生命末端质量。
姑息护理的基本内容有:①控制症状,特别是控制疼痛,包括PCA技术,WHO推荐癌症镇痛三阶梯止痛法,药物阻滞,放射治疗,基因治疗等。②支持患者,让患者参与决策,尊重其自主权。告知病情及进程,与患者商量护理计划,及时反馈治疗效果,提供必要的信息来源和社会支持。③支持家属,姑息护理视患者和家属为整体。患者亲属存在迁就、绝望、厌烦、疑虑、恐惧死亡的心理,护士应同情和理解他们,耐心倾听他们意见和要求,并指导他们承认现实,从容应对,在患者面前保持良好心态。④死亡教育:要让患者清楚,死亡是人生发展的必然结果,从某种意义上讲,死亡是痛苦的自然解脱方式。面对死亡,不要惋惜,要顺其自然,更无须后顾之忧,亲人自会平安生活,未尽事业后继有人,让患者达到“生如春之灿烂,死如秋之静美”的境界.4癌症音乐护理音乐作为一种非语言性沟通手段,常常在进入人的深层意识时,能优于单纯于运用语言治疗的方法,起到普通心理疗法达不到的效果。不同乐曲作用于人的感觉器官,产生镇静情绪、改善睡眠、增进食欲、缓解疼痛等不同作用。
音乐护理的方法:①音乐演奏法:由患者自己演奏音乐,以达到充分散发压力和感情的目的。也可以组合演奏。②音乐欣赏法:护士根据情况安排一定的时间听音乐或播放歌曲。患者通过听觉、视觉等欣赏音乐,用音乐本身具有的内在涵义及魅力帮助患者康复。
音乐对癌症患者生活质量有较好的干预作用。李桂兰等报道:音乐疗法有助于癌症患者情绪稳定,减轻其在化疗过程中产生的焦虑、恐惧等不良心理反应,提高机体的自我调节能力。万永慧等?认为:音乐疗法可减少癌症患者的状态焦虑和特质焦虑,是一种受患者欢迎的辅助治疗方法。王保胜等研究结果表明:音乐疗法可较快改善癌症患者的焦虑、抑郁的心理状态,对患者有镇静、镇痛作用,并能减轻因放疗引起的恶心、乏力等症状。
5癌症疼痛护理
据报道每天有350万以上的癌症患者有疼痛症状,晚期癌症患者70%左右以疼痛为主诉,其中5O%属于剧烈疼痛,对患者生存产生极大负面影响。近年来,国内外控制疼痛的方法不断发展及完善。
大家普遍认为,护士首先要掌握癌性疼痛的分级标准,英国的Weng—Baker面部表情量表,采用六种面部表情,从微笑到悲伤甚至哭泣来表达疼痛的程度,各年龄组从三岁至很虚弱的老人,该方法经大量使用后,都肯定了其实用性和合理性疼痛护理方法包括:①建立家庭式病室,给患者创造一个良好的环境,病室的布置要安静整洁,优美温馨。②建立良好的护患关系,护士要做到语言文明,举止端庄,操作熟练,以取得患者的信任,使患者敢于面对现实,积极配合治疗,顽强地与疼痛作斗争。③药物止痛,在止痛药的应用上要有长期安排,打破按需给药的旧观念,采用分阶段复合给药方式,使疼痛在尚未开始或刚开始便得到控制,保证药物在体内维持一定浓度,这样不仅能避免剂量的逐渐增大医学教育|网搜集整理,还可减少患者对疼痛的恐惧感。④其他方法:包括患者的自我控制止痛法(PCA)、药物阻滞,破坏神经痛觉通路法及神经外科手术方法等。
护士要掌握患者疼痛的信息,正确评估疼痛的程度,根据患者不同情况,做出及时有效的处理。
6癌症社会支持护理