时间：2024-01-12 14:44:01
导语：在基因多态性的概念的撰写旅程中，学习并吸收他人佳作的精髓是一条宝贵的路径，好期刊汇集了九篇优秀范文，愿这些内容能够启发您的创作灵感，引领您探索更多的创作可能。
0引言
原发性肝癌（primary liver cancer，PLC，以下简称肝癌）是常见的恶性肿瘤。由于起病隐匿，早期没有症状或症状不明显，进展迅速，确诊时大多数患者已经达到局部晚期或发生远处转移，治疗困难，预后差，严重威胁着人们的身体健康和命安全。已知原发性肝癌与肝炎病毒感染、生活方式及环境等因素相关，但仅有小部分暴露于这些危险因素的人群发生肝癌，说明遗传易感性在其中起着重要的作用。由于代谢酶基因的多态性，基因变异引起相应酶表达的异常，导致个体对毒物或致癌物的反应不同，从而对肝癌的易感性也不同，而中医体质学是从中医角度揭示宿主个体遗传特征的重要手段。现对肝癌的中医体质易感性及分子遗传相关指标基因多态性进行初步探析。
1.原发性肝癌的中医体质易感性
《黄帝内经》在一定范围内所阐述的理论已具有体质概念的雏形，如《素问？经脉别论》云：“勇者，气行则已;怯者，则着而为病也。”勇怯，即体质的强弱，强调了体质是决定发病与否的重要因素之一。中医体质学说是以中医理论为指导，研究人体各种体质特征、类型和生理病理特征，并通过体质特征分析疾病的发生、发展及转归，是在先天禀赋和后天获得的基础上形成的，具有形态结构、生理和心理状态方面综合的、相对稳定的固有性质[1]，并且根据中医理论和四大体质特征（形态结构、生理机能、心理特点、反应特点）提出了9种体质类型：平和质、气虚质、阳虚质、阴虚质、痰湿质、湿热质、血瘀质、气郁质、特禀质，并且认为体质状态决定了发病与否及发病的倾向性[2，3]。因此，不同的体质特征决定了个体对肝癌的易感性。
中医认为，肝癌的产生多倾向于正虚和邪实，如《诸病源候论》：“积聚者，由阴阳不和，脏腑虚弱，受于风邪，搏于腑脏之气所为也。”《杂病源流犀烛・积聚Y瘕痃癖痞源流》认为：“壮盛之人，必无积聚。必气人正气不足，邪气留着，而后患此。”由于个体体质类型不同，对病邪的易感性亦不同。研究发现肝癌患者的偏颇体质主要以气虚质、阳虚质和湿热质为主，其高发体质为血瘀质，手术患者以湿热质、血瘀质、气虚质为主，并且存在性别差异：男性以气虚、阳虚和湿热为主，女性以阳虚质为主;并且体质类型与西医TNM分期及Okuda分期有一定的相关性，TNMⅠ、Ⅱ期患者以气虚质和阳虚质居多，ⅢA期以气虚质和湿热质为主，ⅢB期以上患者以阳虚质、气虚质为主。Okuda 分期Ⅰ期、Ⅱ期以气虚、阳虚和湿热质为主，Ⅲ期以气虚质和阳虚质为主[4-6]。
此外，体质状态可以预测疾病预后。预后与演变的结果虽然与感邪轻重、治疗是否得当等有关，但在相当程度上还是由体质因素所决定的，致病因素相同，但由于体质差异，转归预后也有所不同。研究发现，中医体质与生存期有一定的关系，气虚质是影响肝癌预后的强独立危险因素，气虚质是预后最差的一种体质[7，8]。
2.原发性肝癌的基因多态性
肝癌的发生发展是众多基因与环境因素共同作用的结果。研究表明，代谢酶基因多态性在肝癌的发生中有重要作用。环境致癌物质，如吸烟和大量饮酒是患肝癌的危险因素。目前与肝癌相关的易感基因单核苷酸多态性（single mucleotide polymorphism，SNP），主要是毒物代谢酶基因、DNA损伤修复基因等方面。
目前研究较多的代谢酶基因多态性主要集中在细胞色素P450（cytochrome P450，CYP）超家族、谷胱甘肽S-转移酶（glutathione Stransferase，GST）、N-乙酰化转移酶（N-acetyltransferase，NAT）、环氧化物水解酶（epoxidehydro lase，EH）、乙醛脱氢酶（aldehyde dehydrogenase，ALDH）等。CYP450 I可以激活香烟中的环芳烃类致癌物，形成亲电子二醇环氧化物，后者可与DNA结合，造成了DNA损伤。若DNA修复不完整，使修复基因缺陷，则会造成染色体畸变和癌基因、抑癌基因突变，最终造成细胞癌变。研究证实，肝细胞癌（HCC）组织中CYP基因表达下降，而癌旁和正常组织中表达逐渐增加，可推测在HCC发生发展过程中，CYP相关基因表达下调或失或可导致癌原的活化，从而促进肿瘤的发生和发展。谷胱甘肽转硫酶（Glutathione S-transferases GSTs）是一类非常重要的同工酶超家族，参与众多亲电子致癌物质的解毒及多种抗癌药物的代谢，其中与肝癌研究关系较多的是GSTM1和GSTT1。长期大量饮酒可使GSTM1和GSTT1的个体患肝癌的危险性显著升高。微粒体环氧化物水解酶（microsomal epoxide hydrolase，mEH） 是目前研究最多的环氧化物水解酶。EPHX1可使环氧化物水解酶活性下降，使过多的环氧化物在体内蓄积，后者可与DNA鸟嘌呤N7位点共价结合，引起DNA单链的断裂和碱基变位，可能使肝癌发生的危险性增加。
此外，致癌物或其代谢产物攻击机体细胞时也会引起DNA损伤。目前发现参与人类DNA损伤修复的基因有130多种。事实证明，不同的组织中，DNA修复基因缺乏可能会增加患恶性肿瘤的风险，如常染色体隐性遗传疾病中的Bloom综合征、着色性干皮病等。
3.中医体质学说与基因多态性
中医体质与基因均表现为先天禀赋的差异。中医体质学说认为，体质在某种程度上决定着疾病证候的倾向性，同样又是决定病性、病位、病程阶段和病变趋势的重要因素。而基因是个体体质差异的分子学基础。基因在DNA分子中能表现生理功能的序列，而个体秉承父母的遗传信息，决定个体在后天的生长过程中要遵循某种既定的内在规律，这种特征在人类的整个生命过程中是不会轻易改变的，同时受先天遗传因素和后天环境因素的影响。两者分别从宏观与微观角度阐释了个体对疾病的易感性。基因多态性的研究成果可以从微观角度探求不同中医体质类型的遗传基础。通过对慢性无症状HBV携带者（chronic asymptomatic HBV carrier，ASC）阴虚体质与人类白细胞抗原（human leukocyte ，HLA）-DRB1、DQA1基因多态性的内在联系的探讨，结果发现，HLA-DRB1*09、HLA-DQA1*0301可能是ASC非阴虚体质患者的分子基础;HLA-DRB1*11、HLA-DQA1*0501可能是ASC阴虚体质患者的分子基础，提示HLA-Ⅱ基因多态性与中医体质有一定相关性。而基因多态性与中医体质在疾病的发生发展及转归过程中发挥了一定的作用。通过观察中医体质类型与HBV感染不同临床状态的关系，同时结合HLA-DQA1基因多态性探讨中医体质因素在CHB发病中的作用，结果提示，阴虚和痰湿质人群感染HBV易发展为CHB，平和质人群则易呈自限性经过;对于已感染HBV的人群而言，湿热质者较易或较早发生肝组织炎症而导致疾病进展，阴虚质、瘀血质者也倾向于出现不良结局，平和质与阳虚质者更多保持病毒携带状态。这些研究为临床通过调节病理体质，发挥中医治未病的优势，延缓病情进展，并且为中医体质学说与现代医学的内在联系提供一些思路。
中医药治疗可以从整体进行功能调节。通过对肝癌患者体质进行分析，了解疾病的本质，根据肝癌患者体质以及其机体表现的不同证型辨证论治，注重调整患者机体脏腑、阴阳、气血等体质特征，改善机体的代谢能力和免疫能力。已有研究证明，虽然中药干预不能直接改变基因结构的作用，但可调节基因表达，达到纠正病理状态的目的，使体质状态发生有利于健康的改变。
4结语
目前，对原发性肝癌的中医体质易感性与基因多态性之间的发生发展及转归过程的内在机理尚无相关研究。分子生物学的发展使人们认识到，基因多态性是不同个体在进化过程中基因组与内、外环境相互作用的结果，是个体对疾病的易感性差别的原因。体质是证候形成的基础。对原发性肝癌而言，揭示其体质、证候与基因多态性的内在关联，采用有效的中药调整，减少该病的产生、减缓该病的病程发展，发挥中医药治未病的特点和优势。
参考文献：
[1]王琦.中医体质学北京[M].中国医药科技出版社，1995，1
[2]王琦.9种基本中医体质类型的分类及其诊断表述依据[J].北京中医药大学学报，2005，28（4）：1-8.
[3]王琦.中医体质研究的3个关键问题（下）[J].中医杂志，2006，47（5）：329
[4]于红娟.原发性肝癌患者中医体质调查及其证候相关性研究[D].第二军医大学，2012
[5]胡学军，龙顺钦，杨小兵等.原发性肝癌的中医体质调查分析[J].时珍国医国药2010，21（4）：995-997.
[6]胡学军，杨小兵，吴万垠等.中医体质类型与原发性肝癌TNM分期及Okuda分期的相关性[J].时珍国医国药[J].2011，22（3）：738-741.
关键词分子标记;概念;基本原理;特点
中图分类号Q78文献标识码A文章编号 1007-5739(2009)11-0264-07
随着人们对生命认识的不断加深以及遗传学的不断深入发展,越来越多的遗传标记被发现,遗传标记的种类和数量越来越多。主要分为4种类型,即形态标记、细胞学标记、生化标记和DNA分子标记。显然,前3种标记都是以基因表达的结果(表现型)为基础,是对基因的间接反映;而DNA分子标记则是DNA水平遗传变异的直接反映。与表型标记相比,DNA分子标记具有能对各发育时期的个体、各个组织、器官甚至细胞作检测,既不受环境的影响,也不受基因表达与否的限制,数量丰富,遗传稳定,对生物体的影响表现“中性”以及操作简便等特点。分子标记的所有这些特性,奠定了它具有广泛应用性的基础[1-2]。
1分子标记的来源及定义
1.1分子标记的来源
“标记”一词,根据汉语大词典的解释,是“便于识别的标识或者记号”。随着人们对生命本质认识的一步步加深,在人们研究DNA序列时发现了大量的非编码序列,甚至占到了全序列的90%以上。这些非编码序列具有特殊的一级结构,如串联重复、回文结构、Alu序列(反向重复序列)、CpG岛等,并且全基因组分布[3]。随着人类基因组计划的人类基因组框架草图的完成和一个个模式生物的全基因组测序,一个个新的DNA特异序列被发现并且在染色体上定位,整个基因组内的标记密度越来越高,并且大量的特异序列与不同的基因片段有着不同程度的连锁,所有这些标记构成了人类研究探索各种生物基因组DNA的地图与路标。
1.2分子标记的定义
广义的分子标记指可遗传并可检测的DNA序列或者蛋白质。蛋白质标记包括种子贮藏蛋白和同工酶(不同基因位点编码的酶的不同分子形式)及等位酶(同一基因位点上不同的等位基因编码的酶的不同形式)。狭义的分子标记仅仅指DNA标记,一般所称的分子标记即被界定在此范围之内[4]。这是因为在应用上DNA标记比蛋白质标记广泛的多。蛋白质的结构比DNA的结构复杂的多。构成蛋白质的氨基酸有几十种,而构成DNA的碱基只有4种,通过指数级的排列方式仅是其一级结构的可能性就有数量级上的差异,且不计蛋白质更加复杂的二级、三级、四级结构及其结构域。并且到目前为止,蛋白质的复制与合成远不及DNA复制技术成熟,可控性也不高。因此,蛋白质标记应用远不如DNA标记方便和广泛。但从更严格的意义上讲,蛋白质标记是研究生命现象更为精确的标记,因为其更稳定、多态性更高,每种蛋白质都是唯一的(序列唯一、构象唯一)。
1.3理想的分子标记
理想的分子标记必须达到以下要求:①具有高多态性;②共显性遗传,即利用分子标记可鉴别二倍体中杂合和纯合基因型;③能明确辨别等位基因;④遍布整个基因组;⑤除特殊位点的标记外,要求分子标记均匀分布于整个基因组;⑥选择中性(即无基因多效性);⑦检测手段简单、快速(如实验程序易自动化);⑧开发成本和使用成本尽量低廉;⑨在实验室内和实验空间重复性好(便于数据交换)[5]。
特别需要提出的是,所有的分子标记都必须满足和某个基因或者已知标记紧密连锁(连锁程度越高越好)甚至共分离。
但是,目前发现的任何一种分子标记均无法同时满足以上所有要求。使用者可以根据自己的实验目的和要求具体选用某种标记技术。
2目前常用分子标记的基本原理
2.1限制性片断长度多态性(RFLP)
限制性片断长度多态性(Restriction Fragment Length Pol-ymorphism)是指用限制性内切酶处理不同生物个体的DNA所产生的分子片断大小的差异。此技术基于生物个体的基因组的变异,是研究不同基因组间的差异的技术,由Grod-zicker于1974年首先提出。其基本原理是:物种经过长期的进化,各个种属甚至品种之间的同源DNA序列上的限制性内切酶识别位点不同,或者由于突变、重组等原因引起限制性内切酶位点上的核苷酸的变化。若引起DNA分子某一特定内切酶识别位点序列内发生变化,这样该位点就不能被切开,使得DN段比亲本长;若突变后形成新的酶切位点,则酶切后的片断变短。这样,通过电泳可以将大小不同的片断区分开来。对于分子量较小的质粒DNA就可直接观察到DNA长度的差异,但对于核DNA而言,DN断呈连续分布,无法辨别差异,需通过Southern杂交转移至支持膜上,用单拷贝或低拷贝的DNA克隆作为探针与膜上的酶切片断杂交,通过放射自显影或非同位素显色技术,发生变异的材料显示的带就可能与亲本的带处于不同位置。检测出与此标记DNA相关的片段构建出多态性图谱,即为RFLP[5,6]。这种特定的限制性片断与DNA探针的组合,便可以作为遗传标记。由于RFLP起源于DNA的变异,不受显隐性关系、环境条件和发育阶段的影响,具有遗传的专一性和稳定性的特点,在数量上不受限制,可随机选取足够数量能代表整个基因组的RFLP标记,而且每个标记变异大,检测方便。用于检测RFLP的克隆探针可随机选取,可以是使核糖体DNA、叶绿体DNA,也可以是总DNA。这样就可以获得能够反映遗传差异的大量多态性,为进行资源分析、品种鉴定、物种进化、基因定位、亲缘关系和遗传距离的分析,遗传图谱的构建提供了有力的工具。并且RFLP是共显性标记,能够区别出杂合体与纯合体[7]。虽然RFLP具有结果稳定可靠,重复性好,特别适合建立连锁图等优点,但也具有检验步骤多、周期长、成本高等缺点。并且RFLP对DNA多态性检出的灵敏性不高,RFLP连锁图谱上还有很大的空间区(gap),甚至在使用同位素时可能对人有一定的伤害等等,这些都是需要进一步完善的地方。
2.2随机扩增多态性DNA(RAPD)
随机扩增多态性DNA(Random Amplified Polymorphi-sms DNA)是美国杜邦公司的Williams和加利福尼亚生物研究所的Welsh等领导的2个小组于20世纪90年代同时开发出来的一种新的DNA指纹技术。此技术是应用一系列随机引物扩增并寻找多态性DN段的遗传标记技术。这一技术建立于PCR反应基础之上,以随机的短脱氧核苷酸(通常为10个碱基)作为PCR引物,对基因组DNA进行扩增而产生多态的DNA图谱。扩增产生的片段可通过琼脂糖电泳或聚丙烯酰胺凝胶电泳分开,经溴化乙锭染色或银染色得到多态性的DNA图谱后进行多态性观察。在基因组上,每个引物可以连续直接扩增特定的DN段,对一个特定的基因型来讲,这些扩增的片段或片段的类型是唯一的。它的应用是基于这样的一个理论:对于同一模板DNA,用同一引物扩增既可能得到相同的带谱(模板基因组间可能具有同源性),也可能得到不同的带谱。仅在某一特定模板中出现的条带即可作为该模板的分子标记[8,9]。事实上,不同基因组DNA总是有一定差异的,所以用RAPD即可进行分子标记研究。理论上讲,在一定的扩增条件下,扩增的条带数取决于基因组的复杂性。对特定的引物,复杂性越高的基因组所产生的扩增条带数也越多。
RAPD所用的一系列引物的DNA序列虽然各不相同,但对于某一特定引物来说,它同基因组DNA序列有特定的互补区域。这些特定区域在基因组的分布如果符合PCR扩增的反应条件的话,即引物在模板上的2条链如果有互补位置并且与引物的3′端在200bp以内,就可以扩增出这一片段。如果基因组在这些区域内发生插入、缺失或者替换即可导致这些特定的结合位置分布发生变化而使PCR产物发生增加、缺失或者分子量发生改变,通过对PCR产物的检测,即可找出基因组DNA在这些区域内的多态性[10]。由于RAPD分析时所用的引物数量极大,并且引物序列随机,虽然对某一引物而言检测的区域有限,但是利用一系列引物可以检测的区域几乎可以覆盖整个基因组。与RFLP是从一系列酶切片段中寻找多态性片段不同,RAPD是利用PCR随机合成多态性DN段,检测被扩增区域内的遗传特征变化。其具体优点体现在:①极大的丰富性,能反映整个基因组的变化;②强大的可探测性,无需合成特定的引物;③高效性与灵敏性。短期内可以得到大量的扩增片段,只要是遗传特异性的发生变化,即使亲缘关系很近的个体也可以识别出[11]。
RAPD最大的特点是引物的碱基序列是随机的,所用引物通常多达几百种,并且1套引物可以用作多个物种或者群体,所以RAPD技术在用于遗传多样性和品种鉴定的研究中具有极大的优越性。因此,用来鉴定品种纯度是很有用的。据报道[9],从玉米、大豆、小麦及红三叶草干种子中提取DNA并成功地利用RAPD技术扩增DN段;中国科学院遗传所陈洪等利用OPP-18引物成功地鉴定了杂交水稻汕优63杂种纯度,鉴定结果与田间小区种植鉴定完全一致。RAPD技术反应灵敏、多态性强,操作简便,速度快,费用低,既有大量的随机引物可供筛选之用,又不受种属的限制,被广泛用于多种作物的种子鉴定[9,11,12]。
由于是随机引物对整个基因组进行多态性检测,在技术上简单易行不需要克隆制备、同位素标记、Southern印记等预备性工作,所需DNA样品量少,安全性好,价格便宜,是继RFLP之后应用最广的分子标记。由于引物没有特异性,1套引物可用于不同生物基因组的的分析,分析速度快,短期内可得到大量的遗传标记,并克服了同工酶位点少和RFLP操作技术复杂的弊端,已经广泛应用于遗传作图、基因定位和克隆、物种进化及鉴定特殊染色体区段的鉴别和分离以及动植物育种等方面,特别是在寻找与目的基因连锁的分子标记方面,近年来报道了大量的与各种目的基因连锁的RAPD标记。水稻的Xa-21 基因和西红柿的pto基因的成功分离就是首先找到了与目的基因紧密连锁的RAPD标记,然后通过定位克隆的方法克隆了目的基因[13]。
与PCR相比,RAPD具有以下特点:①RAPD使用的是随机引物,不需要预先了解目的基因和相应的序列;②操作简便,实验周期短,能在较短的时间筛选大量样品;③引物具有普遍适应性,适用于自动化操作分析。
与RFLP相比,RAPD具有以下特点:①RAPD分析只需要少量模板,1次扩增仅需20~100ng,这对于DNA量很少的材料进行基因组分析有利。比如对花粉粒、原生质体、种子等的DNA分析是切实可行的。②RAPD标记具有更大的随机性,亦有利于图谱的构建。对于DNA含量大的和多倍体物种,RFLP探针会与多倍体的多个片段杂交,所得到的混合指纹会对其他等位基因的阐明带来困难。而且由于DNA量较大,进行单拷贝的Southern杂交不很实际,至少需要很长的曝光时间,并且已知的探针数量有限。RAPD大大增加了可构建遗传图谱物种的数量。③无需借助于有伤害性的同位素,耗费的人力物力少。④灵敏度高。引物中的个别碱基的变化会引起扩增条带和强度的剧烈变化,这是RFLP所无法比拟的。短期内可以得到大量的扩增片段,只要是遗传特异性发生变化,即使亲缘关系很近的个体也可以识别出。⑤RAPD标记可以覆盖整个基因组,包括编码和非编码区,可以反映整个基因组的变化。但是,由于引物的竞争性等,基因组的RAPD位点有时不能全部检出,造成假象上的差异,这在种属亲缘关系的研究上尤其明显。⑥RAPD产物有大于50%的条带扩增于单拷贝区,经过克隆和序列分析后,可作为RFLP和原位杂交的探针,在基因定位、克隆及辅助选择育种中可以广泛应用。
随着RAPD日益广泛的使用,其不足之处也逐渐显现,比如标记的显隐性位点性,致使其不能在后代中区分杂合体和纯合体;稳定性差,由于是单链引物随机的结合,在众多的反向重复序列上,每次的实验结果可能不一致。解决办法是对单链引物进行筛选,优化PCR条件;高度的变异性,即使在亲缘关系很近的物种间,结果也可能差异极大;Tm值低的随机引物易受外界环境影响,如Mg2+浓度等[8,9,14]。
由于RAPD技术是由多种成分参加的生化反应,反应中各种成分均为微量,尽管其反应灵敏度高,但是影响因素较多,故而RAPD受环境影响很大,稳定性差,重复性也不好,因此对实验的设备、条件及其操作的一致性很严格,这又大大限制了它的使用。为了得到较稳定的结果,各种反应参数必须事先优化选择,操作中每一步都必须小心谨慎,以防止出现差错。
2.3特征序列扩增区域(Sequence-characterized amplified regions,SCAR)
RAPD标记一般表现显性遗传,但若某RAPD片段不是重复序列,也可将其转化为RFLP标记。另外,为了提高某一理想RAPD标记的稳定性,可首先将其克隆并对其末端测序,之后,在原来RAPD所用的10bp引物上增加合成上述末端序列的14bp的核苷酸,以此为引物对基因组DNA再行扩增分析,此即SCARs(Sequenced Characterized Amplified Regions)标记[15]。
SCAR首先由Parar和Michlmore(1993)提出并应用。SCAR标记是在RAPD技术的基础上发展起来的。其基本步骤是:先作RAPD分析,然后把目标RAPD片段(如与某目的基因连锁的RAPD片段)进行克隆和测序,根据原RAPD片段两末端的序列设计特定引物(一般比RAPD引物长,通常24个碱基,是在原RAPD引物的3′与5′端延长14个碱基),利用两端各24个碱基的引物再进行PCR特异扩增,这样就可把与原RAPD片段相对应的单一位点鉴定出来。这样的位点就称为SCAR。总的来说,SCAR比RAPD和其他利用随机引物的方法在基因定位和作图中的应用更好,因为它有更高的可重复性(原因是使用的引物长),标记是共显性遗传的[16]。
该方法与RAPD相比,具体有如下优点:①由于有较长的引物,退火温度较高,因此具有更高的检测稳定性;②有将显性RAPD标记转化为共显性的SCAR标记的可能性;③如果是显性标记,则在检测中可以直接染色而不需电泳检测。另外,用RAPD找到扩增片段后不再设计引物,而是直接测序后通过电脑软件分析(如用ClustalX软件进行对位,MEGA软件计算DNA序列间的差异百分率和转换/颠换数,UPGMA软件建亲缘关系树状图等),找出特异性的碱基作为鉴定的特异性标记[17]。
2.4与RAPD技术相近的分子标记种类
下面提到的所有技术都是利用1个或2个短的富含GC碱基的随机引物。
(1)DNA扩增指纹图谱(DNA amplification fingerprint-ing,DAF)[18]。与RAPD技术不同的是,在DAF分析中,引物浓度更高,引物长度更短(一般5~8个碱基),只有2个温度循环(在RAPD中是3个温度循环),并且往往用聚丙烯酰胺凝胶电泳,DAF通常会产生非常复杂的带型。
(2)任意引物PCR(arbitrarily primed polymerase chain reaction, AP-PCR)。AP-PCR使用的引物较长(10~50个碱基),但PCR反应前2个循环的严谨条件较低,最终的反应结果与RAPD类似[19]。在AP-PCR分析中,扩增分为3个部分,每个部分要求的条件和组分的浓度存在差异;在第1个PCR循环中,引物浓度较高;引物长度不定,并且常常来自为其他目的而设计的引物(如M13通用测序引物)。
2.5扩增片段长度多态性(AFLP)
扩增片段长度多态性(Amplified Fragment Length Poly-morphism),亦称选择性限制片段扩增(SRFA, Selective Res-triction Fragment Amplification),是荷兰Keygene公司的Za-beau Marc和Vos Pieter于1993年创建的一种新型的分子标记,并于当年获得了欧洲专利局专利[20]。
它是RFLP和PCR相结合的分子标记技术,既有RFLP的可靠性,又有PCR(如RAPD)的灵敏性,多态性高。其基本原理是利用PCR技术选择性扩增基因组DNA双酶切后产生的限制性片断。基因组经2种限制性内切酶消化以后将一双链DNA人工接头(artificial adapter)连接于限制性片断两端。然后根据接头序列和限制性位点附近的区域的碱基序列,设计一系列3′端含数个随机变化的选择性碱基的PCR引物进行特异性条件扩增,只有那些限制性位点的侧翼序列与引物3′端选择碱基相匹配的限制性片段才能得以扩增。这些选择性碱基数目的多少主要是由待测样品的基因组大小决定,选择性碱基数目多,选择性就强,扩增产物就少;反之,其数目就少,选择性弱,扩增产物就多。扩增产物经变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离显示其多态性。当不同基因组DNA中因为突变引起限制性位点的数量发生改变或2个限制性位点之间的区域内发生碱基插入、片段消失或顺序重排时,电泳谱带显示多态性,多态性以扩增片段的长短不同和数量多寡显示出来[21]。
AFLP的技术特点包括以下几个方面:①使用2种内切酶消化模板DNA。一些酶的切割位点较多,如MseI、TaqI、XbaI等,另一些酶切位点较少,如PstI等等。采用双酶切割的原因是:多切点酶产生小片段,便于凝胶分析切点数少的酶减少扩增片段,由于AFLP反应中扩增片段是2个酶共同酶切的片段,这样减少了选择扩增时所需的选择碱基数。双酶可以进行单链标记,从而防止电泳中因为双链泳动不均而产生的双带假象。并且可使少量引物产生许多不同的引物组合,从而产生大量的不同的AFLP指纹图谱[22]。另外,不同物种基因组的AFLP过程中使用的限制性内切酶也不尽相同。EcoRI可靠廉价,是6碱基内切酶的首选。分析真核生物基因组时大多使用MseI(4碱基),因为MseI的识别序列是TTAA,而真核生物基因组富含AT序列,与TaqI相比(其识别序列为TCGA),可以获得更多的便于PCR扩增和电泳分离的小片段DNA[23]。②AFLP的接头为双链寡核苷酸。人工合成时接头未进行磷酸化处理,所以只有1条单链连接于酶切片段的末端。③与常规的PCR相比,AFLP的引物有其独特性。其引物有3部分构成:与接头互补的核心序列、内切酶识别序列以及3′末端的选择性碱基。该类引物的一个重要特征是通常以鸟苷酸G开头,这样可以有效的形成双链,不过当dNTP浓度过低时容易形成双链结构。此外,选择性碱基的数目影响着AFLP反应的特异性。研究表明,引物带有1~3个选择性碱基时扩增的选择性较好。当选择性碱基超过4个时,扩增的错配程度超过了允许程度,故而AFLP的选择性碱基数目一般不超过3个,具体数目取决于基因组的大小。研究表明,分析500Mbp以下的植物基因组时用EcoRI+2(2个选择性碱基)/MseI+3引物组,500~6 000 Mbp的基因组应采取EcoRI+3/MseI+3较为严谨的引物组。微生物通常采用1个选择性碱基的引物组[24]。④AFLP的PCR扩增分两步进行。首先预扩增,其扩增产物经过一定比例稀释后,以此为模板再进行选择性扩增。两步扩增可以减少扩增产物中的非特异性带,降低了不清晰电泳造成的指纹图谱的背景,提高了指纹图谱的清晰度,还可以增加扩增片段数,为AFLP分析提供充足的模板。
AFLP技术不仅具有其他分子标记的优点,即位点数量无限,呈典型的孟德尔遗传,无表型、复等位效应,不受环境影响等,还具有一些独特的优越性,如标记异常丰富,典型的AFLP反应中,1次电泳可得到100~150个扩增产物,其他标记技术难以达到。稳定性、重复性好,应用非常广泛,可用于任何生物基因组的遗传分析。与PCR技术结合,可在短时间内得到大量多态性标记。同时对模板浓度不敏感,模板需求量也小。Vos Pieter在对番茄基因组AFLP分析时,证实了模板浓度在相差1 000倍以内(0.000 5~25ng)获得的指纹图谱基本一致。另外,在AFLP中标记的引物会全部耗尽,引物耗尽后,扩增的带型不受循环数的影响。这样模板浓度即使不一致也可以通过增减循环次数的方法获得强度一致的带型。目前,AFLP是构建基因组特定区段高密度连锁图谱的最有效的方法。此外,AFLP全基因组分布非常适合构建遗传连锁图谱。AFLP也可以用于检测DNA库(DNA pool)克隆的DNA大片段的多态性,而且其多态性的标记大多对应于基因组的某一位置,这样就可以和STS一样,成为遗传图谱(genetic map)和物理图谱(physical map)之间的桥梁[25,26]。
实际操作中,影响AFLP指纹图谱结果的因素很多。因此,应采取质量高、纯度好、分子量大的的基因组DNA作为模板。如果模板中含有其他杂质或者DNA降解很严重,导致酶切不完全,许多未经酶切的模板片段经电泳后产生表现为高分子量的条带(假带),导致不能真实地反映被测物种的多态性。为了避免电泳的条带过多或者过少,应对PCR反应体系进行优化,筛选出最佳的引物组合。PCR扩增时,应在模板变性之前加入Tag酶和dNTP,否则会导致扩增失败。反应体系中的dNTP浓度不能过低,否则扩增产物容易形成双链结构[21,27]。
2.6序列标签位点(STS)
序列标签位点(Sequence -Tagged Site,STS)指的是一段序列已知并且能够在基因组中作为“路标”使用的DNA序列,是对由特定引物序列所界定的一类DNA标记的统称。其最大特点就是利用特异PCR,因此结果非常可靠。显然,成为STS必须满足2个条件:①序列已知;②位置确定并唯一。从理论上讲,任何一段DNA都可以成为STS。但是,由于需要的是与某一个目标性状基因或已知的标记紧密连锁的DN段,因此能够利用的STS数量则非常有限。根据单拷贝的DN段两端的序列设计1对特异引物扩增基因组DNA,产生的一段长度为几百bp的特异序列在基因组中往往只出现1次,从而能够界定基因组的特异位点。在人类基因组作图中已用其作为将遗传图谱与物理图谱整合的共同位标,这在基因组作图上具有非常重要的作用。随着大量的模式生物的全基因组测序,会有越来越多的可利用的STS被发现。
2.6.1表达序列标签标记(Expressed Sequence Tags,EST)。EST是指一小段(通常长度300~500bp)单次重复的mRNA序列或cDNA序列。它们在特定的组织或者特定的时期内特异的表达,可以看作是特定的cDNA文库中的标记。EST计划由美国科学家Venter于1989年提出,并首先应用于人类基因组研究,之后被广泛用于植物基因组研究,它是通过大规模的cDNA随机测序,从而获得对基因组认识的一种研究策略。目前,许多国家和组织正在开展某些作物基因组EST计划的研究,如成立于1998年的国际小麦族EST协作网(International Triteace EST corperation,ITEC),就是致力于麦类EST研究和开发的[28]。近几年来,国际公共数据库中的EST序列呈指数增长,截止到2006年8月,美国生物信息中心(NCBI)数据库Genbank已公布涉及205 000种生物的61 132 599条EST序列,总长度共65 369 091 950bp。
快速增长的ESTs数据为SSR标记的开发提供了一个巨大的有价值的来源。首先,避免了传统SSR标记开发需要构建基因组DNA文库等烦琐步骤,而且从ESTs中发掘出的SSR只是ESTs测序计划的副产品,从而节省了大量人力物力[29];其次,其本身是功能基因的一部分序列,所以它将为功能基因提供“绝对”的标记[30]。同时,由于不同物种间基因共线性和保守性,从一种作物中开发的EST-SSR可同时用于其他作物研究,从而能够为比较基因组学和同源基因克隆提供新的途径[31]。现在EST-SSR已被用于构建遗传图谱、分离与鉴定新基因、基因表达差异研究、比较基因组研究和制备DNA芯片等方面。
另外,还有一种被称为GSS序列的标记。GSS序列本质上和EST序列是一样的,不同之处是它的序列直接来源于基因组而不是mRNA或cDNA。它通常有以下几种来源:①全基因组检测得到的特异/单次重复序列;②来自质粒/BAC/YAC克隆所得到的单次重复序列;③基因组外显子捕获;④通过Alu―PCR得到的序列。
2.6.2微卫星(SSR)。微卫星(microsatellite)又叫做简单重复序列(Simple Sequence Repeat)或者短串联重复序列(Short trandem repeat,STR)、简单序列长度多态性(Simple Seque-nce Length Polymorphism,SSLP)。简单序列重复多态性(Si-mple Sequence Repeat Polymorphisms,SSRP)微卫星指的是真核生物普遍存在的遍布整个基因组的排列为2~5个核苷酸的短串联重复序列,如(CA)n、(GT)n、(CAG)n等,尤以(CA)n重复序列最为常见,其长度由重复单位的拷贝数决定。在真核生物基因组中微卫星很丰富,通常长度能够达到150bp,是一类呈高度多态的遗传标记,不仅可用于基因组遗传连锁图的构建以及基因的定位与克隆,而且可用于遗传性疾病的连锁分析和基因诊断。其重复单位数目的改变可以引起相当高的多态性,但突变率仅为0.5×10-4~5.0×10-4,在家系中可以稳定地遗传,是一种很好的遗传标志[32]。
微卫星约占真核基因组的5%,其基本构成单位一般为1~8bp,多位于编码区附近,也可位于内含子、启动子及Alu序列(反向重复序列)中。人类基因组约有5~10万个(CA)n重复序列。通常认为重复序列的产生是由于在遗传物质复制过程中DNA滑动或在有丝分裂、减数分裂期染色体不对等交换所致,因此该重复序列多存在于不经严格选择的基因组区域。目前普遍认为微卫星充当基因重组的热点是基因重排和变异的来源[33]。微卫星不稳定性(microsatellite instabi-lity,MSI)是指由于复制错误(replication error,RER)引起的简单重复序列的增加或丢失,也称RER阳性或RER表型。MSI首先在结直肠癌中观察到。微卫星通过改变DNA结构或通过与特异性蛋白质结合而发挥其基因调控作用。
由于微卫星的寡核苷酸在同一物种的不同基因型之间差异很大,可以利用特异引物进行PCR扩增。引物根据与微卫星重复序列两翼的特定保守序列设计,用来扩增重复序列本身。由于重复的长度变化极大,所以这是检测多态性的1种有效方法[34]。其特点包括:一般检测到的是1个单一的多等位基因位点;共显性遗传,故可鉴别杂合子和纯合子;得到的结果复性很高。为了提高分辨力,通常使用聚丙烯酰胺凝胶电泳,它可检测出单拷贝差异。也可以在同1个反应试管中把PCR反应与不同的SSR引物结合起来(称为multiplexing),这可节省时间,但是,这只能在不同引物的产物在大小上下不重叠的情况下才能使用[35,36]。很显然,使用SSR技术的前提是需要知道重复序列两翼的DNA序列的信息,这一方面可以在其他种的DNA数据库中查询,否则就必须先建立含有微卫星的基因组文库,再从中筛选可用的克隆,进行测序,然后设计合适的引物。同时,这种由保守序定的微卫星序列也具有染色点的特异性,因此1981年Miesfeld等首次发现微卫星后,很快成为1种常用高效的分子标记。统计分析表明,不同的物种其微卫星的突变频率也是稳定的。SSR的PCR引物也是对某一高变重复位点高度专一的。用特定引物扩增出相应的微卫星片段后,再通过电泳分离,差异可经过EB或者银染后观察。一般种群可显示出超过10种类型的等位基因。微卫星不仅重复单位变异数大,而且其重复区域总长度又在PCR易于扩增的区域,快速简便,所需的DNA用量小。与等位酶相似,微卫星是具有独立的共显性基因。由于微卫星的遗传中性并且比等位酶法有更多的可供检测的等位基因,这样就可以提供更加精细的基因变化的范围,因此在种群研究上有着更大的应用[3,34,37-39]。
简而言之,微卫星的最大优点在于通过简单的PCR扩增即可直接检测到已知的特定的染色点,不仅具有一般PCR操作简单、快速、成本低的特点,还具有RFLP的稳定可靠、特异性、共显性等特点,不足之处是其引物开发难度较大,技术复杂,周期长,成本也高。不过随着众多模式生物的全基因组测序的飞速进展,对全基因组了解的日益全面,各个大型数据库的逐步完善,并且借助越来越发达的计算机计算和预测技术,使得开发成本有所降低。
2.6.3其他具有特定引物的分子标记种类。
(1)加锚微卫星寡核苷酸(Anchored microsatellite oli-gonucleotides)。Zietki-ewicz et al(1994)对SSR技术进行了发展[40],他们用加锚微卫星寡核苷酸作引物,对基因组节段而不是重复序列本身进行扩增。在SSR的5′端或3′端加上2~4个随机选择的核苷酸,这可引起特定位点退火。这样就能导致位于反向排列的间隔不太大的重复序列间的基因组节段进行PCR扩增。这类标记又被称为ISSR(inter-simple sequence repeat)、ASSR(anchored simple sequence repeats)或AMP-PCR。这类标记往往是显性遗传的。在所用的两翼引物中,可以1个是ASSR引物,另1个是随机引物。如果1个是5′端加锚的ASSR引物,另1个是随机引物,则被称为RAMP技术。
(2)CAPS(Clea-ved amplified polymorphic sequence)。CAPS技术又可称为PCR-RFLP。所用的PCR引物是针对特定的位点而设计的。其基本步骤是:先进行PCR扩增,然后将PCR扩增产物用限制性内切酶酶切,再用琼脂糖凝胶电泳将DN段分开,用EB染色,观察。与RFLP技术一样,CAPS技术检测的多态性其实是酶切片段大小的差异。在酶切前进行RCR产物检测,其多态性称为ALP。Neff et al.(1998)在此基础上又发展出dCAPS技术(derived CAPS),这是检测单核苷酸多态性的一种良好方法。
(3)单引物扩增反应(single primer amplification reaction,SPAR)。SPAR技术与RAPD技术相似的是也只用1个引物,但SPAR分析中所用的引物不是随机的,而是在SSR的基础上设计的,例如可能的序列是(TA)10或(CGA)6。扩增的是SSR之间的DNA序列。又称为MP-PCR(microsate-llite-primed PCR)。
(4)小卫星区域DNA直接扩增(directed amplification of minisatellite region DNA,DAMD)。直接用小卫星的核心序列作引物进行扩增。
(5)Inter-Alu PCR like genomic profiling。与SPAR技术相近,也只用1个引物,但所用的引物是在Alu序列(反向重复序列)的基础上设计的,扩增的是copia(另一种反向重复序列)序列之间的DNA序列。
(6)ISTR(inverse sequence-tagged repeat)。这种技术与SPAR技术也相近,所用的引物是在copia序列的基础上设计的,扩增的是copia序列之间的DNA序列。
(7)IFLP(intron fragment length polymorphism)。检测的对象是内含子的长度差异。根据内含子两端的特征序列设计引物,扩增出长度不同的内含子片段。
(8)RAMPO(random amplified microsatellite polymorph-ism)。RAMPO的英文全名与RAMP的英文全名相近,但实验方法却不同。RAMPO的基本步骤是:先用1个单一的随机引物(即RAPD引物)对基因组DNA扩增,用电泳将扩增片段分开,然后,把凝胶转移到尼龙膜上,使之与一个带有放射性标记(或其他标记)的与SSR互补的寡核苷酸探针如(CA)8和(GA)8杂交,放射自显影后可得到新的多态性类型。
先找到RFLP标记后,对RFLP探针进行测序,再合成适当的PCR引物,这样可发现新的STS标记。这也可称为RFLP-PCR。
3抗性基因同源序列(RGA)
近年来,在各种农作物抗性育种的进程和模式生物的抗性研究中,在水稻、玉米、番茄、马铃薯、烟草、拟南芥等植物中克隆了若干抗性基因,包括植物对病毒、细菌、线虫的抗性基因。例如烟草抗花叶病毒基因、水稻抗白叶枯病基因Xa-21、拟南芥抗丁香假单胞杆菌基因RPS2、亚麻抗锈病基因L6以及甘蔗抗胞囊线虫基因HS1等。
Leister等通过分析研究已克隆的植物抗病基因的结构特征,发现很大一部分的抗病基因都含有NBS保守序列。同年,《美国科学院院刊》在同一期发表了2篇应用同源序列从大豆中克隆R基因同源序列的报道,从而引发了同源序列法在植物抗病基因研究中的应用。随后的大量研究表明,植物抗病基因中存在多种类型的保守结构域。Hammond Kosack和Parker通过分析已克隆的植物抗病基因结构,将植物抗病基因分为8 类,其中,含有NBS-LRR(富亮氨酸重复子Leucine-rich Repeats,LRR)结构域的抗病基因是最主要的类型。
这些结构可能是参与蛋白质之间的相互作用或者细胞信号的传导以及识别。根据抗性基因的这一共性,以其保守结构的序列为基础设计引物,在任何作物中,用PCR技术扩增和分离具有相似序列的DN段,即抗性基因同源序列。
RGA提供了一种快速鉴定候选抗性基因的便捷途径。目前已经利用此技术在小麦、大豆、马铃薯中鉴定了候选抗性基因,它们在基因组的位置基本上就在已知的抗病基因区域。已知基因包括抗病毒、细菌、真菌和线虫的基因。而且部分与抗性基因紧密连锁的标记本身就是抗性基因或者抗性基因的一部分。因此,应用RGA进行基因定位可以较快地检测到与抗性基因紧密连锁的分子标记。可以预见,RGA将成为抗性基因定位的重要手段,并且在分子作图的领域将发挥更加巨大的作用[41,42]。
4单核苷酸多态性(Single nucleotide polymorphisms,SNPs)
单核苷酸多态性是指2套基因组的DNA序列两两进行位置比对时, 单个核苷酸的的不同而显示出的差异(多态性)。因此,SNP反映了过去多数突变事件的特点,2个个体在同一位点携带的不同等位基因被认为是进化的遗传标志。显而易见,SNP是目前已知的多态性最高的分子标记。据Genbank估计,如果比较2套人类基因组的DNA序列,出现SNP的频率可达1/2 000~1/1 000,看起来这个频率并不高,但是考虑到人类基因组共有3.2×109bp时,即可能出现3.2×1012个SNP位点时,这个数量已经相当可观了。并且这只是2套基因组之间的比较,所有的SNP位点肯定比这个数字大得多。水稻中SNP分布频率也很高,平均1 000bp就有1个SNP,这些标记随着水稻基因组的实施而被发现和利用。由于SNP具有同一个位点多态性低而全基因组多态性又极其丰富的特点,并且分析时只需要进行阴/阳性分析而不需进行片段的长度分析,特别适合用DNA芯片技术进行大规模的扫描分析,是继微卫星后最为高效的标记。不过其昂贵的成本(开发和使用的成本都很高)使其应用受到一定的限制。建立可供利用的SNP标记需经过以下几步:①全基因组测序;②根据测序结果确定特定的序列标记位点;③对STS进行扫描,寻找SNP位点;④确定SNP;⑤将SNP定位到染色体上。
5单链构象多态性(Single Strand Conformational Poly-morphism,SSCP)
SSCP是指DNA单链构象的多态性,是基于PCR扩增而新发展起来的一项检测DNA多态性的分析技术。在进行SSCP分析时,利用PCR特异的扩增出基因组目的DN段,然后将这些扩增出来的DN段进行变性处理,使双链DNA分开成单链,再用非变性凝胶电泳分离。由于在自然状态下,单链DNA会折叠卷曲,形成一定点空间构象,这种空间构象是由DNA链的碱基序列决定。如果扩增的目的DN段序列的碱基发生了变异,就可能造成其单链的空间构象发生改变,从而影响其单链电泳时的迁移速率,导致其在电泳图谱上的带纹位置不同,显示出不同生物个体DNA的特异性。
6新型分子标记的开发及其应用前景
自从20世纪70年代第1代分子(RFLP)标记出现以来,分子标记家族迅速发展繁荣起来,并且准确性和灵敏性也一步步提高。目前的SNP技术已经可以在单个核苷酸的水平上找出不同样本之间的差异,即使它们之间的亲缘关系非常接近。
纵观分子标记的发展,是伴随着人们对生命本质的认识一步步加深,认识范围从宏观表型一步步逼近微观世界的进程同步发展的。任何一个特殊生命现象的发现,都可能导致革命性的理论或技术的产生,DNA双螺旋理论的提出导致了DNA的自我复制理论,又进而导致了PCR技术以至于后来的全自动PCR仪的问世(当然也少不了其间Taq聚合酶的发现)。比如各种类型的外切酶和内切酶的发现导致了RFLP技术的产生。
重大的技术突破来源于理论的突破性进展,重大理论的提出来源于无数细微现象的总结。回顾20世纪生命科学的重大突破:1900年孟德尔的遗传理论被重新认识;1920年,摩尔根的基因理论和连锁遗传的提出;1953年,DNA双螺旋结构理论的提出;直到90年代,自动PCR仪的出现。从此,人们又进入了一个众多实验现象的重复和积累的阶段。已经有很多不能解释甚至是矛盾的试验现象在陆续出现。可以预言,下一次的理论突破将导致更加革命性的发现,也必将使得分子标记技术能够从更加深的层面上解释生命现象本身,人们对分子标记的认识和利用也更加深刻和简便。并且随着计算机技术的迅速发展,使得人们不仅能从浩如烟海的数据和现象中发现总结规律,还能够根据现有的现象和规律来预测可能的现象乃至规律。根据目前的发展来看,分子标记的用途不会再局限在传统的生物、医学、农业等领域,还会扩大到诸如数据加密传输、计算技术等领域。
7参考文献
[1] 黎裕,贾继增,王天宇,等.分子标记的种类及其发展[J].生物技术通报,1999(4):19-22.
[2] 郑康乐,黄宁.标记辅助选择在水稻改良中的应用前景[J].遗传,1997, 19(2):40-44.
[3] 樊叶扬,庄杰云,吴建利,等.应用微卫星标记鉴别水稻籼粳亚种[J].遗传,2000,22(6):392-394.
[4] 贾继增.分子标记种质资源鉴定和分子标记育种[J].中国农业科学,1996,29(4):1-10.
[5] TANKSLEY S D,YOUNG N D,PATERSON A H. RFLP mapping in plant breeding: new tools for an old science[J].Biotechnology,1989(7):257-264.
[6] HUANG N.pyramiding of bacterial blight resistance genes in rice:maker-aid selection using RFLP and PCR[J].Theor Appl. Genet,1997(95):313-320.
[7] 张汉尧.RFLP在植物遗传育种研究中的应用[J].西南林学院学报,2006, 26(l):75-80.
[8] 刘春林,官春云,李木旬.植物RAPD标记的可靠性研究[J].生物技术通报,1999,15(2):31-34.
[9] 钱惠荣,郑康乐.DNA标记和分子育种[J].生物工程进展,1998,18(3):12-18.
[10] WILLIAMS J K G,HANAFEY M K,RAFALSKI J A,et al.Genetic analysis using random amplified polymorphisms DNA markers[J]. Meth-ods in Enzymology,1993(218):704-740.
[11] 方宣钧,刘思衡,江树业.品种纯度和真伪的分子标记鉴定及其应用[J].农业生物技术学报,2000,8(2):106-110.
[12] 汤复跃,周立人.RAPD和RFLP在大豆研究中的有关进展[J].安徽农学通报,2006,12(6):52-53.
[13] D ZAMIR,S TANKSLEY. A advanced backcross QTL analysis of to-mato[J]. Theor Appl Genet,1998(97):170-180.
[14] 倪新强,王忠华,夏英武.分子标记辅助选择及其在水稻育种中的应用[J].中国农学通报,2001,17(3):58-61.
[15] 罗素兰,贺普超,周鹏,等.与葡萄抗霜霉病基因紧密连锁的分子遗传标记[J].遗传学报,2001,28(1):76-82.
[16] 田义轲,王彩虹,戴洪义,等.与苹果Co基因紧密连锁的RAPD标记的筛选及其SCAR标记转换[J].遗传学报,2004,31(9):919-925.
[17] 刘俊峰,张国珍,马秋娟,等.一个与稻瘟病菌无毒基因AVR-Pik连锁的SCAR标记的分离[J].植物病理学报,2003,33(2):151-155.
[18] LI YU,JIA JI-ZENG,WANG TIAN-YU.Types of molecular markers and their development[J].Biotechnology Information,1999(4):19-22.
[19] WELSH J,MCCLELLAND M.Fingerprinting genomes using PCR with arbicary primers[J].Nucl Adics Res,1990(18):7213-7218.
[20] ZABEAN M,VOS P.Selective reseriction fragment amplification:a ge-neral method for DNA fingerping. Euro pean patent Application 9240-2629[D],1993-03-31.
[21] 王斌,翁曼丽.AFLP的原理及其应用[J].杂交水稻,2003(5):27-30.
[22] VOS P,HOGERS.R,BLEEKER M,et al. AFLP:a new technique for DNA fingerprinting[J].Nucleic Acids Research,1995(23):4407-4414.
[23] 李珊,赵桂仿.AFLP分子标记及其应用[J].西北植物学报,2003,23(5):830-836.
[24] POWELL W,MOGANTE M,ANDRE C,et a1.The comparison of RFLP、RAPD、AFLP and SSR(microsatellite)Markers for germplasm analysis[J].Molecular Breeding,1996,2(3):225-238.
[25] 熊立仲,王石平,刘克德,等.微卫星DNA和AFLP标记在水稻分子标记连锁图上的分布[J].植物学报,1998,40(7):605-614.
[26] 缪颖.AFLP分子标记及其应用[J].亚热带植物通讯,1999,28(2):55-60.
[27] 郑先云,郭豆平,马恩波,等.AFLP分子标记技术的发展[J].生命的化学,2003,23(1):65-67.
[28] 骆蒙,贾继增.国际麦类基因组EST计划研究进展[J].中国农业科学,2000,33(6):l10-l12.
[29] 李永强.基于表达序列标签的微卫星标记EST―SSR研究进展[J].植物遗传资源学报,2004,5(1):91-95.
[30] ADAMS M D,KELLEY J M,GOCAYNE J D,et plementary DNA sequencing:expressed sequence tags and human genome project[J].Science,1991,252(5013):1651-1656.
[31] SCOTT K V,EGGLER P,SEATON G,et al.Analysis of SSRs derived from grape ESTs[J].Theor Appl Genet,2000(100):723-726.
[32] 何平.真核生物中的微卫星及其应用[J].遗传,1998,20(4):42-47.
[33] 朱振东,贾继增.小麦SSR标记的发展及应用[J].遗传,2003,25(3):355-360.
[34] 李云海.用微卫星DNA标记检测中国主要杂交水稻亲本的遗传差异[J].植物学报,1999,41(10):1061-1066.
[35] 李晶,何平,李仕贵,等.利用微卫星标记鉴定杂交水稻冈优22种子纯度的研究[J].生物工程学报,2000,16(2):211-214.
[36] 李晓辉,李新海,李文华,等.SSR标记技术在玉米杂交种种子纯度测定中的应用[J].作物学报,2003,29(1):63-68.
[37] 朱作峰.用SSR标记比较亚洲栽培稻与普通野生稻的遗传多样性[J].中国农业科学,2002,35(12):1437-1441.
[38] 赵勇,杨凯,Akbar arc cheema,等.利用水稻功能基因SSR标记鉴定水稻种质资源[J].中国农业科学,2002,35(4):349-353.
[39] 刘殊,程慧,王飞,等.我国杂交水稻主要恢复系的DNA多态性研究[J].中国水稻科学,2002,16(1):1-5.
[40] ZIETKIEWICZ E,YOTOVA V,JARNIK M,et al. Nuclear DNA diversity in worldwide distributed human populations[J].Gene,1997,(205):161-171.
论文关键词:分子标记,苹果,应用
1DNA分子标记技术
随着人类对基因从现象到本质的认识,遗传标记逐步从形态标记、细胞学标记和生化标记发展到能直接反应DNA水平上遗传多态性的DNA分子标记。与经典的遗传标记相比较,DNA分子标记具有不受材料来源和环境的限制,遗传稳定、多态性高、标记位点多、共显性、选择中性、重复性好、检测迅速、操作简便等优势,所以DNA分子标记被视为理想的遗传标记技术,而且迅速得到发展。目前,已有20多种分子标记技术被发展和利用。基于DNA多态性的分子标记技术主要可以分为三类:第一类以传统的Southern杂交为基础,RFLP(RestrictionFragmentLengthPolymorphism)为代表;第二类以PCR技术为基础,RAPD(RandomlyAmplifiedPolymorphicDNA)、STS(SequenCETaggedSite)、SCAR(SequenceCharacterizedAmplifiedRegion)和AFLP(AmplifiedFragmentLengthPolymorphism)为代表;第三类以重复序列为基础,SSR(SmipleSequenceRepeat)为代表。
随着分子生物学、遗传学、生物化学等学科理论研究的不断深入和实践应用的不断成功,DNA分子标记技术已被广泛的应用于遗传育种、种质资源鉴定、植物抗病基因定位、植物分类等诸多研究领域。经常应用于果树研究的DNA分子标记有RFLP、RAPD、AFLP、SSR和SCAR等。
2DNA分子标记技术在苹果研究中应用
2.1品种的鉴定
苹果是多年生木本植物,栽培历史悠久,不同地域间的种质交流频繁,导致种质混乱,同名异种现象普遍。传统的形态和同工酶分析方法误差大、效率低,难于对相似的品种进行准确的鉴定。DNA分子标记技术直接从DNA分子水平上对果树品种(系)进行鉴定和分类,准确性更强,效率更高,信息量更大,近几年已得到广泛应用。
Koller等用引物P2(5’ACGAGGGACT3’)成功地区分了11个苹果品种。Tancred等将澳大利亚选育的特早熟品种GB-63-43与其余3个相似品种区分开。祝军等应利用AFLP技术区分了25个苹果品种,用RAPD技术区分了16个苹果品种。周爱琴等用RAPD分析绘制了19个苹果生产上主要砧木的DNA指纹图谱,为苹果砧木的鉴定提供了新的依据。
2.2亲缘关系的确定
苹果中存在许多天然杂种,对一些经实生选种或采用混合花粉杂交选育的品种的亲本无法确定,在品种DNA指纹图谱建立的基础上对其进行聚类分析,可将品种进行分类以鉴定物种起源的亲缘关系。苹果品种津轻是日本1936年以金冠为母本杂交育成,经RAPD结合RFLP分析确认其父本为红玉。乔纳金和陆奥是两个三倍体品种,是金冠分别与红玉、印度杂交而成,RAPD分析表明二者都含有金冠的2n配子。王涛等利用AFLP分析了20个重要苹果砧木间的亲缘关系,聚类分析表明苹果属(MalusMill.)中的两个亚属的砧木被分别聚成两个大组,即花楸苹果亚属(SorbomalusZabel)大组和真苹果亚属(Eu-malusZabel)大组。
2.3种质资源的保存
果树种质资源是为生产提供优良品种的源泉,是果树育种和品种改良的物质基础,因此果树种质资源是人类的宝贵财富。遗传资源的长期保存需要消耗巨大的人力物力,核心种质(corecollection)的概念就是为了尽可能降低消耗而被提出的,利用核心种质理论来长期保存种质资源是提高种质资源管理质量和效率的重要途径,它不但要求对种质的农艺性状进行研究,还要研究它们的遗传变异,以避免重复、减少缺失。Mcferson认为分子标记可以用于核心种质的确定。HokansonS.C.等用SSR结合园艺性状建立了苹果的核心种质。
2.4遗传多样性的检测
遗传多样性一般是指种内的差异水平,它反映着一个物种适应环境的能力及其被改造和利用的潜力。遗传多样性是生命系统的基本特征,也是物种适应自然和发生进化的遗传基础。分子标记产物的多态性反映了被测材料的多样性。分子标记是检测种质资源遗传多样性的有效工具。张开春等用38个随机引物进行RAPD分析,在DNA水平上说明了我国的苹果无融合生殖资源平邑甜茶(Malushupehensis)具有丰富的遗传多样性。
关键词：临床医学专业学生；生物化学与分子生物学实验课；转化医学
中图分类号：G642.0 文献标志码：A 文章编号：1674-9324（2015）30-0064-02
随着医学的发展，基础医学与临床医学之间的关注焦点与研究方法差距越来越大，沟通和交流却逐渐减少，最终产生了二者之间的鸿沟，被称之为“基础医学与临床医学之间的死亡谷”[1]。转化医学（translational medicine）又称为转化研究（translational research）。1992年，Choi[2]在《Science》上发表的论文中首次提出了“bench to bedside”的概念；1996年，Geraghty[3]在《Lancet》上发表文章首次应用“translational medicine”一词；2003年，Zerhouni[4]在《Science》上发表的文章“Medicine. The NIH Roadmap”中提出了转化医学的概念，其核心内容是将医学生物学基础研究成果迅速、有效地转化为可在临床实际中应用的理论、技术、方法和药物，在实验室与病房（bench to bedside）之间架起相互沟通的桥梁。不论是基础医学还是临床医学课程，实验教学都是临床医学专业学生教学中的重要环节，只有通过实际的操作和操作中获得的对理论知识的二次习得，才能使临床医学专业学生对复杂抽象的理论知识理解得更加透彻，在实验课中学生的基础医学技能操作也得到很好的锻炼。生物化学与分子生物学是临床医学专业学生所学习的一门重要的基础医学课程，它连接着基础医学和临床医学。在生物化学与分子生物学实验教学中创新性地结合转化医学理念和内容，使学生在掌握生物化学与分子生物学基础知识，培养科学思维能力的同时，兼具有转化医学理念和思维模式的复合型人才的培养，这是生物化学与分子生物学实验教学的一项创新，并影响了实验课内容、方式和教学方法的选择。
一、生物化学与分子生物学的学科特点
生物化学与分子生物学是生命科学的基础，是在分子水平探讨生命的本质，主要包括研究生物体的分子结构与功能、物质代谢与调节，以基因信息传递为中心的现代分子生物学知识。生物化学与分子生物学的主要内容决定了其知识点纷繁复杂，使得学生学习起来枯燥吃力，因此在理论或实验教学过程中，应建立“病例引导型教学”[5]（Case Based Study，CBS），从具体临床疾病现象做引入使学生先有具体模像，然后对疾病相关的生化和分子生物学机理进行分析和讲解，这样“由表及里”地引导教学过程能让学生有层次地学习和理解生化与分子生物学知识，课堂中营造出的“病例-机理”氛围也能使医学生感受到生物化学与分子生物学在临床中的重要性。生物化学与分子生物学又是生命科学领域的前沿学科，新理论、技术层出不穷，具有很强的更新及前瞻性。与日新月异的发展前沿不同，教学所采用的教科书的更新和修订速度较慢，因此不论在理论或实验教学中，教师都应主动在教学过程中添加前沿新发现和技术，这样不仅能引起学生学习的积极性，更能拓宽学生的知识面和对基础知识的理解和掌握。生物化学与分子生物学已渗透到基础医学和临床医学的各个领域，对于医学生来说学好生物化学与分子生物学十分必要，可为后续基础与专业课程的学习奠定基础。
二、生物化学与分子生物学与转化医学的联系
医学生物化学与分子生物学是基础医学与临床医学的桥梁。作为基因组学与蛋白质组学时展产物的转化医学，其研究内容的中心环节之一是生物标志物的研究，涉及到分子标志物的鉴定和作用；基于分子分型的个体化用药治疗，疾病治疗反应和预后的评估与预测[6]。转化医学的主要任务是架起基础科研工作者跟临床医师的桥梁。它的出现使得基础科学重视临床医学中遇到的现象和问题，并根据现象追根溯源寻找机理原因，并能将研究出的机理成果运用到临床问题中，解决临床医学现实中遇到的困难。并在“现象-机理-运用”这一过程中形成及时反馈，使临床研究者修改观察指标或侧重点，同时也相应地使基础研究者修改研究方向，为临床服务，最终使患者受益。其两者都是桥梁学科，与多学科密切联系，特别是与临床知识密切相关。这就要求医学生物化学与分子生物学工作者教学与研究必须以转化医学的理念为指导，从而适应转化型医学人才培养的要求。
三、生物化学与分子生物学实验课与转化医学理念的创新结合
1.引入病例引导型实验内容。在实验教学中，建立“病例引导型教学”（CBS）内容。用具体临床疾病做实验背景，并阐述疾病相关的生化和分子生物学原理，然后对验证此原理所采用的实验技术进行讲解和操作示范，学生即可开始实验操作并完成报告和教师布置的相应思考题。例如，我们使用医院生化化验单的幻灯片来引入血糖这一生化指标，讲述血糖的生化和临床诊断意义，并以糖尿病为病例讲解血糖超标后对身体的影响，在进行背景铺垫后开始讲解葡萄糖氧化酶测定血糖的原理及方法，最后让学生对事先准备好的不同血糖浓度的血浆样本进行检测，获得结果后进行分析：所测样本血糖是否在正常；如果不在正常值范围内，是偏低还是偏高，分别可能的原因是什么。经过这次实验，学生不仅学习了检测血糖原理的实验技术，并对血糖的生化知识和临床运用有了很好的结合学习。
2.引入个性化用药治疗的系统实验内容。转化医学将分子标志物、分子分型的个体化用药治疗及疾病治疗与预后的评估与预测作为最主要的研究内容。在实验中充分融入转化医学科研成果，开展一系列以科研成果如个体化用药治疗为主的内容新颖、应用性强的专业前沿研究性实验，能够极大地调动和培养学生的专业学习兴趣，使学生对目前科学研究领域的热点与关键问题有初步的了解，较好地实现科研与教学的相互转换，相互促进。我们在实验课中创新设置了“限制性片段长度多态性检测人乙醛脱氢酶2（ALDH2）基因多态性”实验。首先为学生讲解整个实验背景：硝酸甘油作为治疗心绞痛的基本药物之一广泛用于临床。研究发现硝酸甘油的舒血管作用通过释放一氧化氮（NO）所介导[7]。乙醛脱氢酶2（ALDH2）具有硝酸酯酶活性，对硝酸甘油转化产生NO起了关键作用[8]，而ALDH2基因中Glu504Lys位点的多态性会影响ALDH2硝酸酯酶活性，用药指导建议，ALDH2 504Lys等位基因携带患者慎用硝酸甘油[9]，所以这一基因多态性位点具有指导临床硝酸甘油的合理用药的重要意义。然后为学生讲解人脱氧核糖核酸（DNA）的提取、聚合酶链式反应（PCR）、限制性内切酶酶切反应和琼脂糖凝胶电泳检测这些关键技术的原理和方法。使得学生对实验背景、目的和所采用技术的原理及操作都能有统一清晰的认识。具体实验流程为指导学生从自己的口腔黏膜细胞中提取自己的DNA，经过PCR特异性地扩增ALDH2基因中含Glu504Lys片段，再经过酶切反应和电泳检测即可获得自己的Glu504Lys位点基因型。通过这一系列综合开放性的实验，以学生自身遗传多态性为背景，将临床个性化用药检测与经典的分子生物学实验结合，不仅极大地激发了学生对实验的关注和投入，训练了实验操作能力，还加强了他们转化医学思维的培养，
3.实验教材的采编。实验教材是实验课程的重点。本教研室认真研究国内外优秀教材，借鉴其经验，同时结合本学院学生的临床需求，精心编写自己的教材，建设与生物化学与分子生物学基础课程配套的实验系列教材。同时也精心挑选合适的转化医学内容穿插入实验教学过程中。
随着日新月异的生化和分子生物学进展，我们也对前沿进展和发现保持持续关注，将更新的内容及时修改、添加到实验教材中。
以上仅是我们作为生物化学与分子生物学教师在转化医学大背景下，在教学改革方面的一些探索的心得及体会，随着转化医学的发展，其内容必将会更新和扩大，作为基础医学教师要敏锐地跟上发展脚步，积极寻找转化医学与生化、分子生物学的结合点，才能为国家培养出基础扎实、科研思维清晰的有用医学之才。
参考文献：
[1]赵玉沛.转化医学本土路线图[J].中国医院院长，2011，（11）：92.
[2]Choi DW. Bench to bedside：the glutamate connection[J].Science，1992，258（5080）：241-243
[3]Geraghty J. Adenomatous polyposis coli and translational medicine[J].Lancet，1996，348（9025）：422.
[4]Zerhouni E. Medicine. The NIH Roadmap[J].Science，2003，302（5642）：63-72.
[5]贾舒婷，张继虹.针对临床医学专业的病例引导型生物化学教学方法实践体会[J].教育教学论坛，2014，（1）：67，8.
[6]闫华.医学科教新任务――促进转化医学[J].中华医学科研管理杂志，2010，（23）：225-228.
[7] Marsh N，Marsh A.A short history of nitroglycerin and nitric oxide in pharmacology and physiology[J].Clin Exp Pharmacol Physiol，2000，（27）：313-319.
一、野生型雌激素受体结构和功能
ER基因定位于q24和q27之间的第6对染色体的短臂上，由8个外显子组成。野生型ER蛋白的相对分子质量大约为 65 000，与雌二醇具有很高的亲和性［1］。ER属于配体激活的核转录因子的大家族，后者包括其他的类固醇激素受体、甲状腺激素受体、视黄酸受体、维生素D受体和大量尚未明确配体的所谓“孤立受体”。用A～F 6个字母分别代表这些受体序列排列中的6个区域。E 区主要组成了配体结合区，该区包括外显子4到8和装配配体结合的一个疏水区。DNA结合区包括二个锌指结构，使其能够与上游雌激素依赖基因启动区的特异性雌激素反应元件或单元（HRE）相协调［2，3］，外显子2和3编码该区域，具有激活功能的为AF1和AF2两个转录区。AF1包括A、B区的大部分，核受体含有两个转录激活功能（AF）区，分布位于受体C端的激素结合区（AF2）和N端区（AF1），AF2为激素依赖性，而AF1是激素非依赖的。AF2还是核受体与其他转录介导因子（共激活因子或共抑制因子等）相互作用的部位。甾体激素受体的每个AF均具有明显的细胞特异性特点，即使对于某一特定的靶基因而言，靶基因启动子的组成特性也能影响AF（特别是AF2）的转录活性。D区包括核的定位信号，即所谓的“桥接区”，它并不依赖于配体结合。
当激素进入细胞后，与受体结合为复合物。激素-受体复合物活化需要一定的温度，至于激素与受体的结合在胞质还是在核内尚有争论。活化的复合物与DNA结合，这种结合具有选择性，与DNA顺序有关。这一结合部分称为HRE.HRE可能由不连续的若干单元组成，其位置不论是在所调节基因转录起始单元的3＇-末端还是5＇-末端方向都有作用。根据这些表现，可以认为HRE属于调节基因中的增强子。激素特异性在于细胞内的特异受体。由于激素－受体复合物与HRE结合，引起DNA构象改变，活化了附近的启动子，从而促使转录。当受体活性化或转化后，其产物作用于染色质的特殊部位，并通过各种酶和激活的RNA聚合酶的活性促进核酸的迅速复制，转录特殊基因信息而合成特殊蛋白质。减弱染色体DNA－ 组蛋白的结合，激活基因而增强其模板活性，进而促进RNA转录和蛋白质的合成。
ER与它的同源配体（主要为雌二醇）结合后引起一系列的受体激活步骤：包括受体与热休克结合蛋白的脱离，大量丝氨酸和酪氨酸残基以及二聚体的磷酸化。激活的受体复合物与HRE序列的回文结构相结合，随后通过ER的AF1和AF2区与其他的转录成分的蛋白－蛋白结构形成激活转录过程。缺乏配体结合区的重组缺失突变能够与 HRE 相结合而激活其转录，这表明了AF1的基本活性，不过此活性水平比激活的野生型受体要低得多。相比较而言，AF2需要配体的存在来获得转录活性，但其活性程度取决于结合配体的性质［4-6］。由于DNA－AF1结合引起兴奋作用，而三苯氧胺能拮抗雌激素对AF2的作用，三苯氧胺和类似化合物的混合兴奋活性可能部分是由于导致了ER的二聚化作用［7］。 有证据表明，不同的激活剂和辅阻遏剂可明显地影响诸如三苯氧胺的混合兴奋剂的反应水平［8，9］。这种复杂的雌激素信号分子途径表明ER的突变和变异在不同组织之间有很大不同，也较难预言。
二、雌激素受体基因的突变
这里的突变概念是指ER基因的DNA序列发生了变化，而变异是指在mRNA或蛋白水平上发生的异常改变，并不涉及DNA的编码异常。这样的受体除本身功能降低或丧失外， 还有可能与正常受体竞争配体、DNA上的结合部位及转录因子等，从而使细胞对相应激素不产生反应。此外，由于三苯氧胺是借助于与雌激素竞争结合受体发挥作用，所以，也就导致这样的乳腺癌对三苯氧胺的治疗不敏感。实验发现完全性的功能性ER基因丢失会导致雌性鼠的导管发育不全［10］。Mahfoudi等［11］发现在鼠的ER基因538和552位点之间发生的点突变能降低其雌激素依赖性转录活性，但并不明显影响激素或DNA的结合。然而，这些突变却能戏剧性地改变雌激素拮抗剂的药物学效应；在表达这些突变的Hela细胞中，三苯氧胺和纯类固醇性抗雌激素ICI164384都变成了强烈的兴奋剂。也有人在Leu540Gln突变中发现了类似的现象。由于这样突变的受体一方面丧失了对其配体的正常生理性结合，另一方面，通过受体非配体依赖性激活的方式，可能就起到了类似促细胞分裂增殖的病理生物学效应，因此这样所谓的“阳性”ER实际上缺乏了它原有的生物学作用，从而降低或丧失了对激素即雌激素的反应性。但除了显示对抗雌激素药物的兴奋反应外，这种突变也同时显示对雌二醇的拮抗作用。这种AF2突变现象在理论上可以解释某些乳腺癌对三苯氧胺治疗不敏感的原因［12］。
Wolf和Jordan ［13］报道了一个MCF－7人乳腺癌的异种移植体，这是对三苯氧胺已经获得了抵抗、却能在三苯氧胺的刺激下进行生长。结果发现它含有在ER配体结合区域的突变，是由于基因351位点上的天门冬氨酸被酪氨酸所替代。进一步研究发现，用突变的ER转染的MDA－MB－231细胞对三苯氧胺的反应与对雌激素的反应相似。因此，自发性的或实验性的ER突变均表明这些畸变会影响乳腺癌对内分泌治疗的敏感程度。Karnik等［14］研究了143 例家族性乳腺癌或卵巢癌病人的ER突变情况，利用SSCP－PCR等方法发现其中3例有在AF1的Gly160Cys 干系替换。这种现象也发生在对照组白细胞DNA中，表明这可能反映了它的多态性，只有5个在外显子 1、3～5和8的第三对碱基的替换发生，但也被认为是多态性缘故，因为这种情况与肿瘤的激素受体或与三苯氧胺的抵抗状况无关，也未伴随有保守的体细胞系突变。
Roodi等［15］调查了118例ER阳性和70例ER阴性癌中的ER突变情况，发现了2例错义突变，5例多态性被检测出，但没有1例与临床病理学特征有关。总之，以上这些研究所发现的突变仅占极少部分。与这些结果不同的是，在 30％以上的乳腺增生过长和其相应的正常组织中检测到有 ER突变，但在未发生病变的正常乳腺组织中未发现有突变。位于外显子4上的赖氨酸替换成精氨酸的突变会引起MCF－7细胞对雌二醇的增殖反应性增加200倍以上，但这种现象是发生在乳腺良性增生性疾病中，至于在乳腺癌中的类似突变尚未见报道。因此，这样低的ER突变频率是难以解释乳腺癌对激素抵抗的现象，至少也不可能对常规的临床检测病例中作出能足以说明问题的解释。
三、雌激素受体基因的的变异
有大量的乳腺癌ERmRNA变异型报道，在正常乳腺组织和其他器官中也有发现。较多的主要是桥接变异，发生ERmRNA 的1个或几个外显子缺失，其他的有隐蔽的桥接变异，发生了新的架接连接，以及外显子的复制，或转录中有非ER性的序列产生。这些结果主要导致转录信息的丢失，翻译紊乱，或者引起转录蛋白结构的不完整，原因是非ER序列中出现的终止转录编码。目前研究较多的是外显子5的变异情况。用它的变异现象来解释ER-/孕激素（PR）+乳腺癌的存在，因为PR的表达是高度依赖于雌激素源性的信号。Fuqua等［16］发现4例 ER-/PR+乳腺癌中有3例的外显子5mRNA水平比野生型ERmRNA要高得多。相对而言，在5例ER/PR均阳性的肿瘤中，其结果却相反。尽管这种是外显子5 缺乏的变异，但这足以引起翻译后蛋白序列结构的改变，引起蛋白长度被截短，相对分子质量也只有40 000，缺乏配体结合区域。当这种变异转染到MDA－MB－231乳腺癌细胞后，它能激活 HRE 接近60％ 野生型受体的效率，它并不依赖于雌激素配体，也不受雌激素拮抗剂的影响。重要的是，从ER阴性，PR弱阳性的BT20乳腺癌细胞中已抽提出了外显子5蛋白，这是在非转染细胞的蛋白水平上缺失变异的唯一证据。
另一个实验是用外显子5变异转染的MCF－7细胞，其生长速度比用质粒转染的对照组要快得多，而且PR水平也高于野生型的细胞［17］，而且它可抵抗4－羟基三苯氧胺的处理，其原因可能是这种变异能够与野生型受体形成二聚体从而不受三苯氧胺的调节作用。临床的资料也进一步佐证，在 ER－/PR+ 或 ER－及其他的雌激素依赖蛋白（如pS2）的肿瘤中，发现有较高频率的变异情况，因而认为这种变异对PR和pS2表达有活性作用。也有报道外显子的丢失会引起受体功能丧失。Dotzlaw 等［18］发现了外显子2或3截短的变异，当将其共同转染到COS－1细胞后，未见有转录发生，所以即使DNA结合区域完好，但当有ER基因的截短变异发生时，将导致无功能性受体的产生。有人在子宫绒毛膜上皮癌和胚胎癌中也发现了类似情况，外显子7的丢失变异也可使转录过程丢失，当在酵母表达载体系统中表达时可抑制其野生型ER的转录活性［19］。由于在几乎一半的ER+/PR－的肿瘤中发现这种现象，说明这种变异可能主要出现在ER功能阴性的肿瘤中，导致所谓ER+的肿瘤对雌激素的反应性降低。由此可见，通过肿瘤的ER变异情况可联系其预后状况，不过这需要丰富的临床资料来证实。
由于所发现的ER变异均是在mRNA水平上，缺乏相应蛋白水平上的证据，有人怀疑这与是否用极其敏感的RT－PCR导致的实验假象有关，认为这是ER基因转录中的正常过程。但事实上，目前所发现的这些变异是具有组织特异性的，而且其受体超家族的其余成员没发生变异。
总之，对于实验中发现的ER点突变可能对其蛋白功能有明显的影响，但就联系临床上乳腺癌的发展和其表现型来看，至少目前的证据还很难证实。而ER的变异主要是在mRNA水平上，鉴于缺乏相应蛋白水平的依据，对于这种变异的临床意义还值得进一步探讨。
参考文献
1 Green S， Walter P， Kumar V， et al. Human oestrogen receptor cDNA： sequence， expression and homology to v-erb-A. Nature， 1986， 320：134-139.
2 Ponglikitmongkol M， Green S， Chambon P. Genomic organization for the human oestrogen receptor gene. EMBO J， 1988，7：3385-3388.
3 Green S， Chambon P. Oestradiol induction of a glucocorticoid-responsive gene by a chimaeric receptor. Nature， 1987， 325：75-78.
4 Kumar V， Green S， Stack G， et al. Functional domains of the human estrogen receptor. Cell， 1987，51：941-951.
5 Webster NJ， Green S， Jin-JR， et al. The hormone-binding domains of the estrogen and glucocorticoid receptors contain an inducible transcription activation function. Cell， 1988，54：199-207.
6 Lees JA， Fawell SE， Parker MG. Identification of two transactivation domains in the mouse estrogen receptor. Nucleic Acids Res， 1989， 17：5477-5488.
7 Berry M， Metzger S， Chambon P. Role of the two activating domains fo the oestrogen receptor in the cell-type and promoter-context dependent agonistic activity of the anti-oestrogen 4-hydroxytamoxifen. EMBO J， 1990，9：2811-2818.
8 Onate SA， Tsai SY， Tsai MJ， et al. Sequence and characterization of a coactivator for the steroid hormone receptor superfamily. Science， 1995，270：1354-1357.
9 McInerney EM， Tsai MJ， O‘Malley BW， et al. Analysis of estrogen receptor transcriptional enhancement by a nuclear hormone receptor coactivator. Proc Natl Acad Sci USA， 1996，93：10069-10073.
10 Korach KS. Insights from the study of animals lacking functional estrogen receptor. Science， 1994，226：1524-1527.
11 Mahfoudi A， Roulet E， Dauvois S， et al. Specific mutations in the estrogen receptor change the properties of antiestrogens to full agonists. Proc Natl Acad Sci USA， 1995， 92：4206-4210.
12 Montano MM， Ekena K， Krueger KD， et al. Human estrogen receptor ligand activity inversion mutants： receptors that interpret antiestrogens as estrogens and estrogens as antiestrogens and discriminate among different antiestrogens. Mol Endocrinol， 1996，10：230-242.
13 Wolf DM， Jordan VC. The estrogen receptor from tamoxifen stimulated MCF-7 tumor variant contains a point mutation in the ligand binding domain. Breast Cancer Res Treat， 1994，31：129-138.
14 Karnik PS， Kulkarni S， Liu XP， et al. Estrogen receptor mutations in tamoxifen-resistant breast cancer. Cancer Res， 1994， 54：349-353.
15 Roodi N， Bailey LR， Kao WY， et al. Estrogen receptor gene analysis in estrogen receptor-positive and receptor-negative primary breast cancer. J Natl Cancer Inst， 1995，87：446-451.
16 Fuqua SA， Fitzgerald SD， Chamness GC， et al. Variant human breast tumor estrogen receptor with constitutive transcriptional activity. Cancer Res， 1991，51：105-109.
17 Fuqua SA， Wolf DM. Molecular aspects of estrogen receptor variants in breast cancer. Breast Cancer Res Treat， 1995，35： 233-241.
18 Dotzlaw H， Alkhalaf M， Murphy LC. Characterization of estrogen receptor variant mRNAs from human breast cancers. Mol Endocrinol， 1992，6：773-785.
在高校遗传学教学中存在许多经典案例，如：果蝇的翅型、体色、眼色等性状的遗传；豌豆的性状遗传以及玉米籽粒的形状和颜色性状的遗传等。其中，还有一个非常重要的经典案例，即血型遗传。自20世纪初至今,ABO血型遗传一直是复等位基因的一个不可缺少的经典案例。随着科学技术的高速发展，血型的经典内涵得到不断提升，新的研究结果使血型遗传所涵盖的遗传学知识点越来越多，内容越来越丰富。因此，以我们身边最常见的表型--血型为案例开展遗传学教学不仅可以将复杂的知识点简单化、形象化，便于理解，还可以将繁多的基础知识串联起来，便于记忆。另外，以血型遗传作为经典案例在遗传学的教学中还可以不断加人新的研究和新的应用，使经典的内涵不断得到新的提升，让学生的视野接触到前沿的科学知识，为日后的科研接力打好基础。
1血型与遗传学之间的重要关系
开展案例教学，案例的选择是关键。血型是人类血液由遗传控制的个体性状之一，与人类的生活关系密切，用途广泛。自1900年到2005年，已检测出约29个血型系统[21。临床上最常用的有“ABO血型系统”、“Rh血型系统”、“MN血型系统”和“HLA血型系统”。这些血型系统涵盖了复等位基因、基因互作之上位效应等遗传学的孟德尔定律拓展原理，基因的表达调控及群体遗传等遗传学的精髓内容。透过这个知识窗口，可以看到遗传学在血型中的奥秘。
孟德尔遗传定律从建立、发展到不断拓展完善，一直都是贯穿高校遗传学教学的核心知识点。由于现在大学生从高中开始就接触孟德尔定律，如果大学教学还是重复高中阶段所涉及的内容，学生的学习兴趣难以提高。在高中知识的基础上，开展案例教学，引入现代遗传学在人类血型上的最新认识，则不但可以给学生一种似曾相识的感觉，还能自然地激起他们深入探索的兴趣。血型的遗传特征及生化基础可以清晰明了地向学生阐述清楚孟德尔定律的一些重要的延伸知识内容。从红细胞血型到白细胞血型，从常见的ABO血型到罕见的孟买、Rh血型，对于假基因、等位基因、复等位基因和拟等位基因等不容易理解的基因概念以及基因之间的相互作用都可以通过血型案例，把学生带入情境之中，在教师的指引下由学生自己依靠其拥有的基础知识结构和背景，在血型案例情境中发现、分析和解决问题，比较轻松地掌握这些容易混淆不清的概念和一些难以理解的遗传学现象，如非等位基因之间的相互作用之上位效应等。
此外，人的血红蛋白基因在不同发育时期的表达调控还涉及遗传学中的表型和基因型之间的关系，真核生物中的基因表达调控模式等知识点。对血型相关的一些遗传疾病进行分析，还可以引申出基因突变和染色体缺失突变及一些重要的遗传标记。血型的遗传学检测方法及临床上的输血原则和溶血、血型互配等现象也与受基因表达调控的红细胞的细胞膜糖基的特征和生化机制密切 相关，引导遗传学从理论到实验，再到实践中的应用。血型与疾病的关联分析，把科研思维引入高校遗传学教学中，让学生紧跟时展的步伐，理论联系实际，为日后的科研工作打好基础。
遗传学中两大重要的主题是遗传和变异，主要包括孟德尔遗传和连锁遗传、基因突变和染色体畸变。通过以复旦大学遗传学教学大纲为参考，与刘祖洞主编的《遗传学》和乔守怡主编的《现代遗传学》教材内容相比较发现，血型遗传案例除了与上述遗传学四大内容关联外，还涉及到基因的表达调控、群体遗传、表观遗传等知识点，其中大部分知识点都是要求学生重点掌握的内容。目前，血型案例所涵盖的主要遗传学知识内容及在遗传学学科中的重要意义的归纳见表1。因此，把血型作为经典案例，开展遗传学的案例教学既贴近生活，引发学生深刻的思考，又能代表性地进一步阐述探讨遗传学的生物知识。
2血型案例在遗传学教学中的开展
在以血型为案例的教学过程中，我们首先根据高校遗传学的教学目标和培养目标的要求，在学生掌握了一些遗传学的基础知识和理论知识的基础上，结合遗传学的教学进度逐步有序地进行介绍：1.血型基本知识介绍；2.红细胞血型的细胞膜糖基特征和生化机制；3.红细胞血型与输血；4.血型的遗传学规律特征，包括(I)ABO血型复等位基因遗传及其应用，（II)ABO血型基因的克隆，（III)ABO血型的遗传学鉴定；5.ABO血型的拓展，包括(I)孟买血型与拟孟买血型，（II)红细胞血型与白细胞血型。下面主表1血型与高校遗传学教学的重要关系
要选取两个方面阐述在遗传学教学中的开展过程。
2.1血型基本知识在教学中的开展
ABO血型系统是第一个被描述的红细胞血型系统，也是最具有临床意义的一个系统。因此，在进行血型基本知识介绍时往往以ABO血型为例。随着以分子生物学为基础的血型研究的发展，ABO血型的基因遗传背景目前已比较清楚。在介绍血型基因的基本知识同时也涵盖着遗传学知识的传播，而且随着血型基因知识的不断丰富完善，涵盖的遗传学知识也越来越广泛。
ABO血型由3个复等位基因控制，即iA、产和i°o在开展遗传学相关教学活动时，一般都用此作为分析生物界中复等位现象的经典例证。这些基础知识对于高校学生来说可能在高中的时候就已经获得。因此，在大学开展相关教学时，除了简单介绍这3个主要的复等位基因外，还可以深入讲述新的研究结果，到目前为止通过分子生物学方法已经确定了160多个^50等位基因，只是目前国际上以4川7基因作为等位基因的参比序列，其他基因均与其紧密相关，非常保守。在此基础上ABO血型又可分为许多亚群，其中A血型表现出最多的亚型。在红细胞血型系统中还有一种Rh血型，分为Rh阳性和Rh阴性。Rh血型主要由3个紧密连锁的基因D/d、C/c、E/e决定，这3个基因以单倍型方式传递，属于拟等位基因。这样在讲解原有知识基础上，又不局限于原有知识范围，由ABO血型到Rh血型，由复等位基因引出拟等位基因，在教学方法上可以通过相互比较，举例分析，扩大学生的知识面，提
高他们的学习兴趣。
人类的血型是不是一生恒定不变的？面对这个问题，很多学生都会认为血型是由遗传决定，不会改变。其实人类的血型也会发生变异，如急性白血病以及再生障碍性贫血可以使血型抗原减弱，骨髓增生异常综合征可以导致血型抗原丢失等。而且，健康人也存在血型变异的现象，但是这个是与细胞表面血型物质受到掩盖以及人体存在一些稀有ABO等位基因有关。这些新的知识可以向学生很好地展示“遗传和变异”，利用身边的血型案例调动学生的学习积极性，使他们积极主动地掌握遗传学的精髓。
此外，最近几年疾病引发基因甲基化和突变的研究'又可以结合表观遗传学的内容开展教学。
2.2红细胞血型的细胞膜糖基特征和生化机制在教学中的开展
人类ABO基因位于9号染色体长臂(9q34)，其基因产物是一些专一性的糖基转移酶，可以催化血型抗原前体特定部位的糖基转移，从而控制ABO血型抗原的生物合成。其中4基因编码产物为N-乙酰-D-半乳糖胺转移酶(简称A酶)，可以产生常见的A抗原；S基因编码产物ci-l，3-D-半乳糖转移酶(简称B酶)，可以产生常见的B表面抗原；和S基因同时存在产生的等位基因，其编码产物具有A酶和B酶的特异性，在红细胞表面上产生不同强度的A和B抗原；而O基因则是第258位和第349位碱基缺失导致的密码子移位，使终止密码提前出现，合成了无酶活性的短肽，因而体内没有A酶和B酶，也不能催化糖基转移，只有前体物质H的产生为H抗原(图1)。因此ABO血型有时也称为八811型[71。这样，不同的、B、0基因编码不同的多肽，产生具有不同功能的糖基转移酶，非常简单地引出了遗传学中经典的基因与酶的关系的“一个基因一条多肽(一个基因一个酶)假说”,使学生很容易获得一个基因决定一条相应的多肽链(酶)的结构，并相应地
影响这个多肽(以及由单条或多条多肽链组成的酶）的功能这种遗传学思想，达到良好的教学效果。
此外，最新研究发现ABH抗原除表达在血细胞表面以外，还可以出现在除脑脊液外的分泌液中；有大约80%的个体具有产生这些可溶性抗原的遗传基因；这种分泌抗原的表达由双结构基因控制，即第19号染色体2个紧密连锁的Ft/n(用和基因座。ABO血型抗原都由前体H物质合成，SeAe基因和丑冷基因都可以控制合成H物质；简单来说，基因的表达决定体液中是否出现ABH抗原，H/h基因的表达决定红细胞上是否出现ABH抗原。但是，并不是所有带m基因的个体唾液中都分泌ABH物质，还要受到Wh基因的制约，其中hh型(即孟买型)均为非分泌型[7]。这样又引出了遗传学中一个很重要的概念--上位基因，很重要的遗传学现象--上位效应。这些属于遗传学中基因互作的重点内容，而且发生基因相互作用的非等位基因仍然遵循孟德尔分离和自由组合定律，后代的基因型及其比例是可预计的，所以在遗传学教学中还可用于亲子鉴定、重大遗传疾病的关联分析、人种演化、群体遗传分析等相关内容。
2.2相关技术的拓展应用
ABO血型的分子检测是分子遗传学教学中PCR技术拓展应用的案例。血型基因的表达影响血型的表现型，表型相同的个体其基因型不一定相同。如何区分iAiA、Pi0在表现型都是A型和iBiB、iBi0在表现型都是B型的个体，可以根据A、B、0血型基因碱基的差异，应用聚合酶链式反应-限制性片段多态性(PCR-RFLP)技术分型人类ABO血型的方法。这种方法可以对个体血型(血型基因型)进行判定：是属于AA型、AO型，还是BB型或BO型。在这个基础上，我们进行了改进，并结合教学进程，作为自选实验在学生中开设，获得了学生的好评。在135个学生中开展自选实验，其中有80%的学生选择ABO血型鉴定这个实验，并表示对这个实验很感兴趣。
此外，还可通过分析核苷酸来确定分泌型ABH血型的Se基因型。主要基因分型技术有：（l)PCR-序列特异性引物(PCR-SSP)，这是一种新的基因多态性分析技术，根据基因座某一碱基的差异设计一系列引物，特异性引物仅扩增与其对应的等位基因， 而不扩增其他的等位基因；（2)PCR-DNA测序法，先通过PCR扩增基因的主要片段，然后测定序列;(3)PCR-限制性内切酶法，用对位点特异的限制性内切酶消化基因，再通过Southernblot分析来确定。目前，PCR-SSP常用于胎儿血型鉴定及白血病引起的血型抗原异常等血型鉴定。随着450基因结构和研究方法的迅速发展，AB0血型定型也将进入基因定型的时代，揭示更多的关于AB0基因和AB0血型表观遗传学等方面的奥秘。
在教学过程中还可以设计一系列与血型相关的论题，引导学生査阅相关方面的最新进展，总结出血型与人类疾病和性格之间的关系以及蕴涵的遗传学原理。学生可以分组制作PPT讨论，还可针对某一论题，学生组队分为正反两方，开展辩论式讨论。一学期可以安排一次课时(45分钟)开展辩论式讨论,前30分钟让学生正反方陈述观点，列举证据开展辩论，后15分钟用于总结和点评。在这个模式下，几乎所有的学生都积极主动地参与进来，将引导、鼓励与考评相结合，充分调动了学生学习的积极性[11]。开展“血型是否可以决定性格”类似专题的辩论式讨论，既增加了遗传学教学的兴趣性及可接受性，还可以使学生的思维在辨析中得到操练。正反两方队员通过收集资料和案例，与同学辩论解释的过程中，不仅掌握了深奥的科学知识，而且还与现实生活相联系，并且将遗传学应用于实际，填补了传统教学在知识灵活认知与实践中的不足。
3以血型为案例开展遗传学教学的优点
作为日常生活中被人们广泛熟知的遗传学常识，血型遗传学的研究历程符合遗传学的发展规律与教学规划，其作为遗传学教学案例有着不可替代的优势：
【关键词】现代生物技术；环境检测；应用
1引言
现阶段，我国常见现代生物技术包括生物传感器技术、生物酶技术以及生物芯片技术等，这些监测技术具有较强的特异性、灵敏性和准确性，操作简单快速，因此在目前的环境检测工作中都发挥了十分重要的作用，大大提高了环境检测的质量和水平，加强对其分析研究有着十分重要的意义。
2现代生物技术的基本简介
现代生物技术其主要包含有分子生物学、微生物学、系统生物学以及免疫学等多种理论，而且与化学、计算机以及微电子等多种学科相互结合，综合性较强，因而，具有十分广泛的应用领域。现代生物技术主要的研究对象是生物，主要的研究目的是为了实现对资源的有效开发和利用，操作过程简单快捷，能够有效地减少资源浪费和环境污染。现代生物技术所开发的产品具有较高的纯度和较高的安全性，产品质量可靠，最大程度地满足了人们的使用需求，实现了连续化的操作，有利于建立资源节约型、环境友好型的生态环境。现代生物技术目前主要在农业生物技术、植物生物技术、医学生物技术以及环境生物技术等领域实现了广泛的应用。
3环境检测中常用的几种现代生物技术
3.1生物传感技术
生物传感器的技术基础是固定化酶技术，能够将识别与感知的信息转化成电子信号，并通过电子信号装置对其进行控制，最后被检测的物质可以通过电子器件检测出来，然后将其转化成已被检测的电子信号。目前生物传感技术是环境检测中应用最多的技术。
3.2基因探针与PCR技术
基因探针技术中的非放射性核酸探针可以应用于环境检测中，主要应用于环境中细菌或病毒的检测，且非放射性核酸探针对病毒及细菌的检测还十分灵敏，核酸杂交技术应用于环境微生物的监测中不仅更加安全可靠，还十分快速有效，目前核酸探针及PCR技术已经广泛应用于水环境中如大肠杆菌、志贺氏菌等微生物的检测。
3.3酶免疫检测技术
酶免疫监测技术是利用抗原和抗体的特异性反应而研发的，该技术将酶进行标记，然后再将标记过的酶与待检测的抗原进行检测，根据其出现的免疫学特征反应通过比对确定待检测病毒或细菌的种类。酶联免疫吸附检测技术是目前应用最为广泛的一种酶免疫检测技术，其主要应用于水质检测中。3.4生物芯片技术生物芯片技术是利用微电子技术研发的一种微加工技术，可以将作为探针的分析固定与于固定相表面，然后根据构建的生物化学分析系统进行分析，从而实现对蛋白质、细胞等生物学组成成分进行快速准确的检测，其主要应用于水污染中的化学物质毒性的检测。
4在环境检测中现代生物技术的具体应用
4.1生物传感技术的应用
数字科技和生物技术的快速发展，各个学科也都实现了不断的进步与发展，并且在发展过程中实现了学科的相互交叉和融合。生物传感技术因其具有高度集成化、微型化以及自动化的特点，因此在环境检测中实现了广泛的应用。生物传感器能够实现生物反应与电信号的转换，为环境检测提供了大量快速有效的分析手段，实现了食品工业以及环境检测的技术革命。生物传感技术的应用理论基础是实现传染物与生物层之间专一的固定化作用，作用原理就是通过被测对象与生物组之间的相互作用，然后利用电子元器件将对被测对象的监测转化为比较容易被识别的电子信号，最终再通过电子信号设备和装置对电子信号进行识别和分析，实现对监测对象的有效控制。生物传感技术具有测定速度快、操作简单、反应灵敏准确、成本低等优点，因此在未来的环境检测中一定会实现更加广泛的应用和推广。
4.2基因探针和PCR技术的应用
不同的微生物病原体具有不同的致病剂量，因此确定水样中病原体的数量和种类提高检测的准确度显得异常重要水体污染问题已引起了人们的极大关注，确定自然水体或污水水样中受病原体或化学类污染物污染的程度和快速确定污染源是一个难点问题。饮用水样品中只有不到1%的微生物可经实验室培养。因此，用传统培养方法研究微生物群落，不能反映环境的真实情况。DNA损伤评价污染物遗传毒性的一个很有价值的生物指标，PCR技术的应用使得在分子水平分析DNA损伤之一DNA突变有了很大的进展，提供了一种在分子水平上分析环境生物DNA损伤和检测病原体的简便方法，该方法克服了传统方法的缺陷，更利于提高环境检测的效率和准确性。PCR有许多不同种类，如实时定量PCR，多重PCR等，用PCR得到的母的片段可用于微生物检测。目前已有将PCR技术用于饮用水中大肠杆菌的检测；用于制备基因工程中的目的片段；用于DNA杂交技术中DNA探针的制备；用于环境生物多态性的分析。DNA探针是用生物素、荧光素等物质进行标记的能够与待测基因进行特异性互补产生杂交信号的DN段。荧光探针、寡聚核苷酸探针等已被应用于监测水中的大肠杆菌，取得了很好的结果。为了更灵敏、快速的检测水中大肠杆菌，目前DNA探针技术多于PCR技术结合使用。PCR技术的基本原理类似于DNA的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。PCR由变性一退火一延伸三个基本反应步骤构成：（1）模板DNA的变性模板DNA经加热至93℃左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备；（2）模板DNA与引物的退火（复性）模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55℃左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；（3）引物的延伸DNA模板一引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA链互补的半保留复制链重复循环变性———退火———延伸三过程，就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。每完成一个循环需2~4min，2~3h就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。到达平台期（Plateau）所需循环次数取决于样品中模板的拷贝。PCR技术在环境检测中的基本原理见图。
4.3生物酶技术的具体应用
目前，我国的环境检测工作中另一个应用比较广泛的现代生物技术就是生物酶技术。①生物酶技术的处理功效高。生物酶技术的作用原理是将微生物与酶进行有效的结合，能够快速有效地进行污染物的降解，从而增强环境检测过程中的污染处理功效。②生物酶技术在环境检测中的适应性更加广泛。生物酶技术有效地降低了微生物的生存要求，为微生物创造了更加适宜的温度和pH条件，大大增加了微生物的作用效果。③生物酶技术与其他方法相比更具有针对性。生物酶技术目前被广泛地应用于不同的领域和不同的环境，因此，在使用时可以充分地根据实际情况进行选择，从而采取更具有针对性和效力的方案进行监测。④生物酶技术的污染治理成本也较低。生物酶技术的应用不需要引进庞大的设备和装置，大大降低了治理成本和投资成本，并且具有显著的治理效果。在此，主要就生物酶技术在处理水污染中的具体应用进行了简要的分析。某城市生活污水处理厂各构筑物内滞留污水总水量约为1.5万t；外观呈现黑色，并散发臭味。经环保部门对滞留污水进行采样监测，监测数据如表1。从表1可知，滞留污水中的COD、NH3-N、硫化物等均超标，最高超标达10倍以上。该滞留污水中混有大量制革废水及化工废水。制革废水由强碱性的浸灰脱毛废水和弱酸性的鞣革废水组成，前者含有高浓度的氯化物、硫化物、表面活性剂、防腐剂、油脂、蛋白质及SS等污染物；后者含有高浓度的鞣料、化学助剂及染料等。制革混合废水呈碱性、有毒性、难降解物质含量高，外观污浊，气味难闻。而对滞留污水投加高效复合生物酶药剂进行应急处置后，高效复合生物酶对于滞留污水中的污染物进行高效催化降解，逐步改善滞留污水的水质状况。投加高效复合生物酶药剂后，一周即可使其中的污染物降解30～50%。由表2可以看出，高效复合生物酶对滞留污水的应急处置有明显的效果。投加高效复合生物酶药剂一周后，经相关环保部门对污水进行采样监测，监测结果见表2。
4.4生物芯片技术的具体应用
在进行环境检测时应用生物芯片技术时能够有效地提高环境检测的质量和水平，使得我国环境检测技术得到进一步的发展。生物芯片技术可以自动、快速、准确地监测出不同基因的表达情况和环境因素对基因的影响作用。生物芯片技术目前所采用的载体主要有组织芯片、蛋白质芯片以及基因芯片等，生物芯片技术通过对细胞基因组的详细分析，准确筛选DNA的多态性变化和突变过程，从而确定出环境污染对生物基因水平的影响，实现对污染的科学监测。随着生物芯片技术的不断发展，其在环境检测过程中逐渐成为新的研究方向和研究概念，未来具有更加广泛的应用前景。
5结语
关键词 病毒学 方法 分子细胞水平
中图分类号：G644 文献标识码：A
相对动物学或者植物学这些传统学科，病毒学是一门始创于20世纪40年代的新兴学科。虽然在此之前，就有发现能通过细菌过滤器的烟草花叶病致病因子的科学家D.Ivanofsky，以及发现具有滤过性的口蹄疫病原的科学家Loeffler和Frosch，但是基于历史条件和知识水平的限制，人们或许观察到了病毒引起的自然现象，却无法对其产出真正科学的认识。
病毒学的里程碑事件应属1935年美国科学家Stanley对于烟草花叶病毒的提纯，使人们不再空泛地想象病毒的存在，而是真切地观察和接触到病毒，为今后的研究开辟了广阔的道路。随后，观察手段，培养方法，以及相关的病理性研究手段的不断提升，也使得病毒学这样一门起步较晚的学科开始了飞速发展。
回顾病毒学研究的发展历程，不难发现，学科的发展很大程度上依赖于技术的进步与革新，以及与相关学科的借鉴与学习。故了解和掌握病毒学方法技术的发展历史以及技术要求，对于学科的研究，以及技术的创新，都有诸多裨益。
1 病毒鉴定检测的相关方法技术
对于病毒最直观的认识无疑是其生物学上特征，如病毒的理化性质（如病毒粒子的形态、大小、对理化因子的耐受性、特外存活期等）以及在寄主上的反应（如寄主范围、症状表现、传播方式等）。目前，病毒生物学特征的研究鉴定方法主要分为三大类：显微成像技术（或相关针对病毒形态结构观察的技术）、免疫-血清学检测和分子生物学检测。
1.1 病毒形态结构的观察技术
众所周知，病毒颗粒的大小远小于普通细菌，所以对病毒最直观的鉴定方法就是使用电镜观察，它可以直接地看到病毒的形态结构、存在与否。自第一台电子显微镜的诞生，这门技术已为病毒学在内的多种生物学科作出了重要的贡献，优点也十分明显，操作简便，快捷有效，所以，即使是在进入了分子研究水平的今天，电子显微镜仍然发挥着它不可替代的作用。
另外，在原始的技术基础之上加以改进也形成了一些针对特殊观察对象的电镜技术，如电镜负染技术和免疫电镜检测技术等。低温电镜技术，就是一种结合电镜技术和低温结晶观察病毒的三维结构的技术，其优点不仅在于其分辨率更高，而且对于病毒样品的损伤和失真的概率都大大减小，常用于极微量和高保真要求的病毒观察检测。
X-射线衍射技术是通过扫射病毒微晶得到的衍射图像来分析还原原始的病毒结构，但为了保证衍射图像的准确性，往往对样品的纯度和颗粒完整性要求较高，所以这种技术的使用范围相对受限。
核磁共振技术，相对于前面提到的技术，对于操作的要求更低，运用范围也更广，但是对于结构的准确性判断略低。此技术主要用于病毒短肽的分析以及蛋白小分子构象变化的研究。
1.2 免疫-血清检测方法
此类技术的原理主要根据病毒的侵染性以及其作为白的特性而设计的。运用最为广泛的还是血清学测试，即利用血清中可以和具有某种特定结构特征的病毒结合的抗体，从而进行病毒的定性定量分析。此法也广泛应用用于医学临床的诊断，操作简便，低廉有效。
酶联免疫吸附实验（ELISA）也是利用特异抗体吸附病毒颗粒的原理，只是在抗体上附带了酶标记，从而使反应可以有颜色强弱的变化，利于定时定量监测病毒浓度。此法灵敏度高，且不受浓度范围或其他抑制剂的干扰，也越来越多地应用于相关的生产实践中。
免疫组化技术也是将抗体带上特殊的显色基团，使其游离时不显色，而于抗原物质结合后显色。利用这个特点，可以检测特定组织中不同区域的病毒含量已经分布特点，利于进行组织性毒理分析。
1.3 分子生物学检测方法
病毒寄生在宿主细胞内，但它又有不同于宿主细胞的特异基因组序列，特异序列的存在就说明病毒的存在，这就是分子生物学检测病毒的原理。
聚合酶链式反应（PCR）是其中最为常用的一种检测手段，其原理即利用DNA半保留复制的特点，以原始DNA为模板合成两条一样的双链，从而达到扩增量指数增长，DNA总量可检测的目的。另外，由于病毒的核酸有的是DNA，有的是RNA，所以常规的PCR以及反转录PCR即可针对不同的病毒基因进行检测。
实时定量PCR与传统PCR基本相同，只是在体系中加入荧光基团，反应中利用CCD实时读取荧光信号，检测。不仅减少的污染和浪费，也使定量快速而方便，可以实现多样品和高通量的反应。
核酸原位杂交的原理是利用生物素编辑的cDNA探针来杂交组织中的样本，从而确定病毒在宿主中的分布和载毒量。该技术，往往与免疫组化一起使用。
dsRNA技术是利用dsRNA在一定条件下与纤维素特异结合的性质，从来快速简便的提取检测出病毒颗粒中的dsRNA等，高效准确，在普通实验室和生产工厂中都有所应用。
2 病毒的分离与培养的相关技术方法
2.1 病毒的提纯技术
作为病毒学研究的重要技术前提，病毒的提纯质量往往影响了后续一系列的步骤，所以其重要性不言而喻。由于病毒的生长特性、理化性质和宿主都差异颇大，提纯的方法也不尽一致。
在病毒研究初期，沉淀法最常被使用，其主要利用病毒的蛋白外壳，改变溶剂性质，从而分离病毒粒子。相对而言简便快速，但也常存在粗糙易变性的缺点。
色谱法源于化学中多组分的分离，由于生物成分的多样性，也常使用该技术。色谱法主要分为吸附法、柱层析法和电泳法，都是利用较为温和的环境，以及病毒的特异吸附或凝集等特质而设计的技术。种类繁多，应用广泛。
超速离心利用样品中不同成分拥有不同的沉降系数，在离心过程中，不同成分会在溶剂的特定位置形成区带，从而达到分离提纯的目的。此法常使用生物活性溶剂，且离心本身对病毒粒子损伤较小，故常用于理想的病毒快速分离技术。
2.2 病毒的获取
最初的植物病毒学和动物病毒学的诸多研究都是建立在活的宿主体系上的，并且至今仍在应用，如生产不能体外繁殖的病毒、研究病毒感染的病理作用、检测疫苗的安全性等。但动物宿主体系存在太多弊病，随着细胞培养技术和分子生物学的发展，有逐渐被淘汰的趋势。
现在，病毒的获取主要是三种途径：从宿主直接获取、感染宿主扩增病毒、直接合成，其中后两种途径使用更为广泛。
感染宿主扩增病毒即要使用到组织细胞培养，这项技术本来属于细胞学的范畴，后由于动物源性或者细菌源性的病毒研究需求，此技术也越来越多地应用于病毒学的研究中。如，空斑分析最初用于测定噬菌体含量，而今也逐渐普及为动物病毒的研究中去。
直接合成法则是利用动物转基因技术，将病毒的遗传信息整合进目标动物中，在动物体内完成基因的表达，蛋白的合成，以及病毒的组装等步骤。而动物转基因技术也是现今生物领域的热点内容，技术繁多，更新迅速，也为病毒的研究提供了良好的基础。
3 病毒的功能机制研究的相关技术方法
3.1 病毒的遗传学的研究
关于病毒遗传学的研究和细菌等微生物的遗传学研究技术相似，如PCR等。但是病毒的遗传物质除了可能是DNA还可能是RNA，而且现在对于RNA病毒的研究居多，所以针对性的技术也与细菌等微生物的遗传学研究技术有所区别。
对于RNA病毒使用最多的是反向遗传学技术，最初即使用反转录PCR得到病毒RNA的cDNA，从而完成病毒基因组的探索工作，以达到了解或有目的性改造病毒基因组实现生产应用的目的。此法对于类型多样的病毒研究提供的最为基础的遗传学数据，为疫苗开发筛选、新型病毒载体等多方面都给予有力的技术支持。
针对病毒易变异的特点，单链构想多态性检测技术（SSCP）则理想地解决了这一问题。近年来，对于多种模式生物的基因组测序的发展，越来越多的研究开始着重于探索基因变异的问题，而SSCP技术正是这样发展起来的。其主要用于检测基因点突变和短序列的缺失和插入，为病毒的分子演化规律以及流行病学提供充分的证据。
基因芯片技术的概念来源于计算机芯片，即将大量寡聚核苷酸以阵列形式有序固定于载体表面，与待测样本的病毒分子杂交，然后利用化学发光或同位素等显色方法，用CCD等仪器对杂交信号进行高效检测分析。主要用于病毒基因表达谱和基因多态性等方面的研究。
3.2 病毒表达机制的研究
在病毒的表达机制研究中，主要是利用不同的检测手段，判断病毒表达的具体情况，并对于病毒表达的情况进行总结归纳，研究其时空上的机制和规律。
Northern Blots即针对病毒RNA样品的技术手段，原理与Southern Blots相似，利用探针与固相RNA杂交，再对探针分子的图像进行捕获和分析。此法特异性高，常用于分析已知基因的表达情况。
mRNA表达差异技术主要使用反转录PCR以及等量不同宿主的定量检测，来确定抗病种和感病种的差异表达基因，从而进一步确定造成品种差异的原因。
3.3 病毒蛋白质的研究
病毒蛋白决定了病毒的形态结构，常作为抗原来激发人体内的免疫反应，作用于宿主细胞信号转导途径，导致宿主细胞内信号转导发生紊乱；并且一些病毒蛋白具有酶的作用，可作为细胞毒素作用于宿主细胞。
大范围而言，病毒蛋白质研究的技术，都隶属于蛋白质组学的研究范畴之内，只不过针对不同特性的蛋白，往往会选取最为有效而简便的技术方法进行研究。而由于蛋白质分子结构、化学生物特性等多方面差异很大的特点，其针对性技术也是五花八门，在此仅列举较为常用的技术，以供研究者学习参考。
经典的方法有亲和层析、抗体受体法、抗细胞受体法、抗独特型抗体法、病毒覆盖蛋白法。大多还是利用病毒蛋白和抗体蛋白或者其他蛋白或大分子物质的作用，来检测病毒蛋白的特性。虽然这些方法快速简便，但是由于方法本身较为粗糙，样品用量较大，准确性存疑等问题，现在仅在低要求情况下使用。
现代的方法则更加丰富，也分别具有各自的特点，常被运用于现在的病毒蛋白的研究。
噬菌体表面呈现技术是利用噬菌体本身表达的两种结构蛋白会暴露在噬菌体表面，故将外源基因倒入两个结构蛋白基因间，使外源序列一起表达，然后让表达产物与大量配体结合，筛选特殊结合性配体。但此法表达出来的蛋白可能与天然状态不符，所以使用较为受限。
免疫共沉淀是一种成熟蛋白作用技术，其原理为在溶液或细胞中，用一种蛋白的抗体耦合可与此蛋白特异结合的另一蛋白，从而形成一抗体两蛋白的沉淀，从而获取具有结合饵蛋白能力的未知蛋白，探索细胞中蛋白作用机制。
酵母双杂交技术是利用真核基因的特殊表达机制，通过将两个蛋白的编码序列整合在同一酵母细胞内的特殊转录激活域附近，若两种蛋白可以发生相互作用，则会激活相应的报告基因，从而报告蛋白的相互作用。此法常用于筛选病毒蛋白的特异膜蛋白受体。
除了以上列举的技术之外，还有cDNA文库技术、质谱分析技术、GST Pull-down技术、串联亲和纯化、荧光能量共转移等多种技术应用于蛋白互作的研究。
参考文献
[1] 黄金海等.蛋白结晶技术在病毒学中的应用.动物医学进展，2003，24（5）.
[2] 金国瑛等.试析免疫组化技术在病理诊断中的应用.医学信息，2011，24（6）.
[3] 杨发龙.Real-time PCR在病毒学研究中的应用.黑龙江畜牧兽医，2008（3）.
[4] 陈贤革.荧光PCR技术应用的研究进展.畜牧与饲料科学，2010.31（2）.
[5] 张晓婷等.双链RNA技术与植物病毒研究.云南农业大学学报，2005.20（4）.
[6] 于佐安等.鱼虾贝病毒分离纯化技术概述.渔业科学进展，2009.30（2）.
[7] 甘露.细胞培养技术.中国组织工程研究与临床康复，2008.12（29）.
[8] 刘新生.动物转基因技术在病毒研究中的应用.畜牧与兽医，2010.42（9）.
[9] 魏太云等.P CR-SSCP技术在植物病毒学上的应用.福建农业大学学报，2000.29（2）.
[10] 彭俊平等.基因芯片技术在病毒学研究中的应用现状，2003.19（3）.
[11] 张英等.反向遗传学技术及在RNA病毒研究中的应用.动物医学进展，2008.29（3）.
[12] 李光玉等.负链RNA病毒反基因操作技术发展之启示.医学与哲学，2003.24（7）.
[13] 郭舒杨等.病毒蛋白质相互作用的研究方法及其应用.微生物学免疫学进 展，2011.39（1）.
人物=P
普雷斯顿・埃斯特普=E
P：你在你的著作《长寿的基因》（The Mindspan Diet）一书中提到，“通过饮食调理我们的基因，积极影响基因表达，就能让我们保持健康的身体状态和旺盛的大脑生命力。其中，低含铁量、低血糖指数的精制碳水化合物（LIGIR），是有益于健康长寿的最佳碳水化合物。”事实上，公众对精致碳水化合物、全谷食物和铁元素对健康的影响有诸多误解，你认为是什么造成了这样的误解？
E：精致碳水化合物目前有一个坏的形象，许多人声称它们会导致超重、肥胖、糖尿病等问题。但是某些精致碳水化合物，如白米饭和面食，在历史上是最好的有助生理长寿和心智长寿（编者注：心智寿命指大脑正常运转的时间和表现，是衡量人体健康的最终指标的基础）的食物。另一方面，人们曾被告知富含铁的食物和全谷物是有益的，但是心智长寿的人从未吃过富铁的食物，也很少吃全谷物。之所以会产生误解，原因有两个：许多科学家忽视了与个人偏见冲突的证据;大多数人和科学家不理解衰老生物学，也不理解随着年龄的增长我们所需的是如何变化的。
P：我们知道缺铁易造成贫血，但是铁元素过量积存却易造成神经退行性疾病，因此在健康平衡上，公众该如何选择含有铁元素的饮食？
E：在食物供应良好的国家，贫血在男性和绝经后妇女中很少见。而铁缺乏的诊断通常需要血液检查，因为人们经常没有明显的症状。重要的是要有合适的血液检测来检测铁含量以确定适合每个人的饮食量。一种血清铁蛋白测试很关键，还有我在《长寿的基因》中讨论的其他类型的测试。
P：你的书中提到日本、地中海地区的人因为拥有良好的饮食习惯，被普遍认为心智更长寿。其他国家的人在效仿他们的饮食习惯时应该注意些什么？
E：有很多重要的因素，包括以下这些：限制红肉和其他富含铁的饮食，从好的碳水化合物（白米、面条等）中得到膳食能量（卡路里），只吃中等量的蛋白质（特别是动物蛋白质），少到中等量的日常鱼和海鲜，并且吃发酵和可发酵的食物。
P：通常，不同的饮食习惯会造成人体肠道菌群的差异，从而影响健康，我们在学习长寿地区的饮食习惯时，会否产生适得其反的效应？
E：不会，大多数人，特别是大体上已经吃得很好的中国人，应该能够毫无问题地过渡。对于大多数中国人来说，最重要的是减少肉类和动物蛋白质的含量，这将提高肠道功能。
P：你提到，“所有的神经退行性疾病都有相同的环境致病因素”，相同的环境治病因素是指什么？
E：这里是指，膳食铁和富含铁的食物。（编者注：《长寿的基因》里写道，心智长寿达人的饮食有许多共同之处，其中之一就是减少铁元素的摄入。）
P：你在书中提到，止痛药如布洛芬，可以降低患神经退行性疾病的风险。请问原理是什么？
E：某些止痛药可以减少痴呆和其他疾病有两种可能的方式：其一，它们减少炎症;其二，它们中的一些抑制脑中蛋白质的聚集，这是造成阿尔茨海默氏病的元凶。
P：载脂蛋白E（apolipoprotein E，APOE，是一种多态性蛋白，其基因可以调节许多生物学功能）和淀粉样前体蛋白（amyloid precursor protein，APP，一种广泛存在于全身组织细胞上的单次跨膜蛋白，其经蛋白酶裂解后会产生具有毒性作用的β-淀粉样蛋白）是影响人们罹患阿尔兹海默症的关键基因，这两者具体怎样作用于阿尔兹海默症？
E：APOE负责将铁转运到脑脊液和脑中。APOE的最致病性变种（称为e4，这是在老年人中唯一最有害的人类遗传变异）比起弱致病性的变种会转运更多的铁到脑中。一旦铁到了大脑中，就会与运输、代谢它的关键组分相互作用，包括编码蛋白质的APP（淀粉状蛋白前体蛋白）。（因而）铁含量的增加会触发淀粉样前体蛋白（APP）的运作，而该蛋白的过量运作最终会导致蛋白质与铁的聚集和脑细胞死亡。
P：如果你是记者，关于你自己和你的书，你还想问什么？
E：记者应该和科学家一样关注论证和论据。如果我是一个记者，我会问“遵循某种饮食的原因是什么？你有什么证据表明这是正确的方法？”《长寿的基因》是唯一的一本分析心智长寿概念和历史上心智长寿人群的著作。它解释了关键的膳食因素如何影响生理寿命和心智寿命。（如果我是一个记者）我也会问包括我自己在内的每一个关注健康膳食的作者的年龄，我会将他们的实际年龄与他们看起来的年龄进行比较，因为外表是衡量一个人衰老得快或慢的一个很好的指标。遵循长寿饮食应该会减慢衰老的，而且是很明显的减慢。我是56岁，大多数人猜测我比我的实际年龄要年轻至少10岁。就在这个星期，一个同事猜测我不过才40出头。此外，我还会问问每个健康饮食作者的关键生物指标的检测结果。而我的所有生物指标（如血液的化学成分）都在理想的范围，包括长寿的生物指标，如血糖和体温。
P：2016年你做过的最正确的决定？
E：我一直很幸运，并在2016年做了很多好的决定。2016年在中国度过了将近两个星期是一个很好的决定。我有机会在一些大型的活动中发言，包括在上海的陆家嘴的TED。我遇到了许多美好的人，包括翻译和出版了我的中文书的湛庐文化团队。我还在清华大学和浙江大学会见教师和学生并做了演讲。总的来说，去到中国，这是一个很棒的决定！
P：在过去一年中，有什么遗憾吗？
E：我总是感到遗憾。即便我是一个快乐的人，但我通常也感到不满意。我有一个了不起的导师，名叫乔治・丘奇，他是哈佛医学院的遗传学教授。乔治有一句名言：“如果你有时没有感到失败，那么你还不够努力。”这就是我相信的，并且我以此为我的生活信条。
购物车(0)